Введение к работе
Актуальность проблема. Последнее десятилетие' отмечено революционными успехами в области биокатализа /см. схему I/. Наряду с развитием традиционных исследований природных ферментов, а также катализа ионами металлов и модельных систем в больней степени на основе кофакторов ферментов, были инициированы работы по получению альтернативных биокатализаторов.
Схема I
Успехи развития биокатализа
Природные- ферменты
Лутантные ферменты, полученные методам о айт-капр авленногс мутагенеза
Биокатализаторы-гибридныг белки
Катализ ионам металлов
Каталитические ВЕК, рибозимы
Модельные системы,
кофакторы ферментов
Каталитические-антитела, природные и индуцированные аб-зимы
С широкім внедрением в энзш.'.ологно техники рекомбинантных ДІК были получены ыутантные ферменты с измененными каталитическими свойствами. Открыта каталитическая функция Ипі, исследованы свойства рибозимов. Другим важнейшим достижением в области биокатзля-за последних'лет является получение каталитических антител или абзимов, моноклоналъных антител на стабильные аналоги переходных состояний ферментативных реакций. Новые направления развиваются в
тесной взаимосвязи с традиционными, обогащая тем самым друг друга как в плане постановки фундаментальных задач, так и методически.
.Действительно, например, само наличке у РНК каталитической функции органически связано с эволюцией бисжатализа /см.схему I/, las многие асфакторы ферментов /модельные-, системы/ имеют нуклеотидную природу, т.е. являются в известной степени фрагментами РЫК. А ионы металлов, участвующие в электродоильном катализе, необходимы для протекания реакции с участием ркбозимов. Для исследования структурно-функциональных взашоотйспекий в ферментах в течение многих лет ранее применялись методы сайт-направленной химической кодификации и ограниченного протеолиза белковой молекулы. В настоящие время эти метода эффективно дополняются методами сайт-направленного мутагенеза и исследования доменной структуры фермента с помощью изучения свойств экспре-ссированнкх фрагментов соответствующее кДКК /биокатализаторы-гибридные белки, см.схему I/. Последний подход нашел свое отражение в данной диссертации.
Появление: абзкмов также нельзя считать неожиданным. Ддея использования высокоаффинного связывания антиген-антитело для имитации столь жз высокоаффинного взаимодействия'аналог переходного состояния - фермент принадлежит В.Д.іенксу. Таким образом, исходя из теории активированного комплекса* антитело; полученное на стабильна! аналог переходного состояния, должно эффективно его связывать и мо-*ет кзлйлкзгроЕать соответствующее. химическое превращение. Неслучайно, что эта весьма понятная, но в то же время глубокая идея получила свою реализацию только в последних исследованиях. Естественном тср.,:озсм исследован;::: в облает:: абгимов в 7С-ие годк лги-
лось е^зг недостаточное развитие представлении с структуре соответствующих переходных состояний ферментативных превращении, методов их синтеза, а также отсутствие технолога .'/.скокдснальных антител, методов их получены и селекции, лан и Есякая смежная область, возникшая на стыке двух традиционных z давко развиваемых направлений - химической энзимслсдии z zxzrjncлегни, -.":"л аезимез потребовала одновременного и интенсиЕнсгс развития как ф::з::кс~:а--мпчєскпх подходов и методой синтетической' сргаЕХчєсксі! :ст.:~-, :.=.:-: и иммунологических методов. Сегодня можно узе с уверенностью сказать, что абзимология бистро акцентировала все современные достп-жения. в исследовании ферментов - сайт-направленный мутагенез, адресованную химическую модификацию белковой молекулы антитела специфическими аффинными метками, методы стационарной и быстрой кинетики и физико-химические:, оптические, методы исследования ферментативных реакций» В этой области с успехом начали применяться все последние достижения гибридомной техники, а также намечаются перспективы по активному использованию методов генетической инженерии антител. Все это может превратить абзимологию из области чисто научного: курьеза в важную фундаментальную ветвь современного Сиокатализа, в практически ценное направление, биотехнологии.
Сегодня, несмотря на то, что круг реакций, натализируе:лых абзи-мами значительно расширяется, необходило признать, что наибольший успех абзимологии достигнут в исследовании реакций, имитирующих действие протешгатических ферментов. Это объясняется проведением достаточно глубоких исследований в области химии переходного состояния, и,в частности, наличием широкого круга фосфорорганических соединений - аналогов структуры переходного состояния с тетраэд-риче.ским атомом углерода. На сегодня нет сколько-нибудь серьез-
4.
нкх исследований в областд абзимологии превращений ДЫК. Это связано с существованием естественных преград развития этого направления - отсутствием доступных аналогов переходных состояний реакции метаболизма ДКК.
Е основу настоящей диссертационной работы положена концепция существования природных абзимов. Наш высказано предположение о существовании природных каталитических антител к ЛдК. среди множества ДІК-ангител., имеющих место при развитии аутоиммунного процесса у ж ловека. Выдвинутая концепция нашла подтверждение в работах группы С.Паула /Университет штата Еебраска, США/, где: обобщены данные по каталитической активности аутоантктел к вазоактивному интеюташаль— ному пептиду.
цель и задачи исследования. Главной целью настоящего исследования явилось расширение, представлений о свойствах и функциях биокатали-- заторов:, исследование функциональных свойств экспрессированнкх фра ментов кДДіС ферментов к экспериментальная проверка выдвинутой гипотезы существования природных ДИК-абзкмов. Конкретными задачами был: I.исследование каталитических сволоте продуктов экспрессии фрагментов к^ял ключевого фермента обмена серосодержащих аминокислот циі татионазк. 2.Исследование функциональных, каталитических своііств продуктов экспрессии фрагментов хДНК топоизомеразы I. 3.Получение актиидиотиличесхих аутоантител к топоизоыеразе и исследование их функциональных свойств. 4.Доказательство наличия каталитической активности у аутоантител.
0„
Научная новизна. Сформулированы представления о функциональной активности зкспресснрованных фрагментов кДНК ферментов, исследования функциональной активности проведены на двух ферментах: цистатконазе и тсг-поизомеразе I. Обнаружена каталитическая активность экспрессированных фрагментов кДЖ нистатионазы. Показано, что каталитические свойства зависят от протяженности экслресюгрованвого полипептвда, Обнаружен фрагмент топоизомеразы, взаимодействующий с моноклональными антителами к ферменту и ответственный за связывание антител из аутоиммунной сыворотки. В'сыворотках крови больных системными аутоиммунными заболеваниями обнаружены антивдиотипические: антитела к топоязомеразе I. Показана их высокоспецифическая ДНК-связыванщая активность. Выдвинута гипотеза о существовании природных каталитических антител и получены экспериментальные данные, подтверждающие; существование ДЖ-гидролизувдих аутоантител.
Практическая ценность.Впервые показано, что топоизомераза I является "характеристическим антигеном"' не только при склеродермии, но и при ряде других аутоиммунных, заболеваний» Рекомбинантная топоизоме-раза, содержавшая фрагмент молекулы, ответственный за связывание? аутоантител, с успехом заменила труднодоступный нативный фермент в диагностических тест-система». Исследование; уровня антиидиотипичес-ких антител к топоизомеразк и уровня антител, обладающих каталитической активностью в сыворотках крови больных аутоиммунными заболе-заниями,может составить основу для разработки прогностических кр_ите-зкев развития системного аутоиммунного процесса, Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 14-т и Іа-ом Международных биохимических конгрессах /Прага, 1988; Иерусалим. 1991/, на IX конференции ФЗБО /Будапешт, I99Q/, на Мездународ-
6.
ной конференции "їопоизомеразн в химиотерапии" /Еатайа, 1991/, на 8-ом Международном симпозиума по Еитамину В^ и карбонильному катализу /Осака, 1930/, на Международной конференции "Ферменты, в органическом; синтезе" /дью-Дели, 19J2/, на Всесоюзном симпозиума "ймму нолосичесхие аспекта аутоиммунных заболеваний и вторичных иммуноде фииитов человека /Новосибирск, 1ЭЗЭ/, на У Всесоюзной конференции "Метода полученая и анализа биохимических реактивов" /Юрмала, 1987, на конференциях научных работ ітлстигута молекулярной биологии, км. Ь.А.Энгелъгардта аЫ. /Лосква, Ia6ci,L93d,laaQ/, на семинарах "Молекулярная иммунология"' /'АЛЕ, 1Э90/, Кафедры биохимии Токийского У: верситета /Токио, 1990/, Кафедры биохимии Университета гЛсукубаД куба, 19Э1/, на Всесоюзном биохимическом съезде. /С-Петербург, 1932,
Структура работы.' Диссертация изложена в настоящей работе в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в ссааторсзз с З.С.Алекберавой, Л.Б.Бронштейнам, Г.ЗЛГололабазым, й.й.Грамовай, О.А.&зашук, Ї.Б.Ирокаєвой, А^.ломутовым, P.M.Хомутовнм, А.М.ІІІусте ром. Вклад других соавторов отражен, в публикациях по тема диссерта дай. Ьсем коллегам автор приносит благодарность за, участие в совмє ных работах и обсуждении результатов.