Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммунная система представляет собой одну из наиболее высоко организованных систеы млекопитающих, адаптировавшую в ходе эволюционного развития комплекс механизмов, позволяющих защитить организм от внешних агентов (патогенных бактерия, вирусов и паразитов). Механизмы гуморального иммунного ответа связаны с выработкой антител - группы белков, которые связывают практически любые природные и синтетические молекулы (антигены) с высокой аффинностью и исключительной специфичностью. Селективное связывание достигается за счет большого числа слабых нековалентных взаимодействия, таких как водородные связи, ван дер Ваальсовы силы и электростатическое взаимодействие,
В 1986 году впервые удалось получить антитела, обладающие каталитической активностью. В дальнейшем область моноклональных каталитических антител (абзимов) получила огромное развитие, и были получены антитела, способные катализировать широкий спектр различных химических превращений, включая реакции, для которых неизвестны ферментативные аналоги. Субстратная специфичность каталитических антител обычно выше, чем у ферментов, и в ряде случаев эффективность катализа под действием антител близка к ферментативной, В последние годы исследователи стали отходить от получения антител, катализирующих простые гидролитические реакции, и исследования абзимов принимают все большую практическую ориентацию. Описаны антитела, смещающие равновесие в сторону образования энергетически невыгодных соединений, обладающие исключительной стереоселективностыо в отношении продуктов реакции, и другие. Одной из наиболее интригующих, но пока нерешенных задач этой области науки является создание высокоспецифичных протеаз на основе антител. Однако катализ разрыва высокоэнергетических пептидной и фосфодиэфирной связей описан для природных каталитических аутоантител, что показывает Принципиальную возможность решения такой задачи современной абзимологией.
Уникальным свойством иммунной системы является способность дискриминировать аутоантигены и внешние антигены. Однако в ряде случаев нарушения в механизмах регуляции иммунного ответа ведут к развитию аутоиммунных процессов, при которых отмечается продукция
-*
антител к аутоантигенам. Наибольший прогресс в области исследования аутоиммунных заболевания достигнут в изучении механизмов индукции и регуляции системной красной волчанки (СКВ). Характеристическим маркером развития СКВ как у человека, так и в мышиных моделях этого аутоиммунного заболевания является продукция аутоантител к нативной двуцепочечной ДНК (нДНК). Принято считать, что аутоантитела к нДНК вносят значительный вклад в патогенез СКВ. Кроме того, интерес к исследованиям ДНК антител обуславливается возможность» их использования в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ДНК-белок в целом. За последние несколько лет антитела к ДНК были детально исследованы, и, возможно, представляют на сегодняшний день наиболее охарактеризованную систему антиген-антитело из всех известных у млеколетающих. Определено ' более 250 последовательностей ДНК антител, исследуются механизмы срыва толерантности и развития аутоиммунного ответа к ДНК, проведено значительное количество иммунохимических и генетических исследований, ведутся работы по кристаллизации комплексов антител с их ДНК субстратами. Тем не менее, причины индукции аутоантител к ДНК при системном аутоиммунном ответе остаются неясными. Самые недавние исследования позволяют предположить, что не нДНК сама по себе, а. комплексы ДНК с ДНК-связывающими белками (гистонами, другими ядерными или рецепторными белками) скорее всего служат основным Иммуногеном для патогенных аутоантител к ДНК. Однако в этом вопросе по-прежнему остается много неясного. Очевидно, что исследования антигенной специфичности аутоантител к ДНК должны помочь идентифицировать эпитопы на ДНК, вызывавшие развитие иммунного ответа к нДНК.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы было исследовать специфичность обусловленного аутоантителами гидролиза ДНК и сопоставить ее со специфичностью ряда ДНК-метаболиэирующих ферментов, определить кинетические параметры взаимодействия ДНК-абзимов р их субстратами, а так же охарактеризовать каталитические функции моноклонального ДНК аутоантитела.
Научная новизна и практическая ценность исследования. В работе впервые детально исследованы закономерности взаимодействия обнаруживаемых при СКВ каталитических аутоантител к ДНК с различными модельными субстратами, выявлены преимущественные субстраты для таких антител, охарактеризованы кинетические параметры гидролиза. Результаты исследования позволяют подробно охарактеризовать уникальные каталитические свойства ДНК аутоантител. Кроме того, впервые продемонстрирован гидролиз ДНК под действием моноклонального аутоантитела BY04-01, изучены его кинетические параметры и специфичность , предложена модель структуры каталитического центра антитела и выявлена роль отдельных аминокислотных остатков в катализе. Полученные результаты могут найти применение в исследованиях механизмов индукции и развития аутоиммунных патологий, закономерностей взаимодействия ДНК-белок и в разработке новых каталитических антител к энергетически стабильным субстратам.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на:
-
International conference on "Modern Enzymology: Problems and trends", 1992, St. Petersburg, Russia.
-
International conference on "Catalytic antibodies and antibody engineering", 1993, Moscow, Russia.
-
16th IUBMB congress, 1994, New Delhi, India.
-
WHO International Laboratory Course on Molecular and Cellular Aspects of Immunology, 1994, Weizmann Institute of Science, Israel.
-
23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, 1995, Basel, Switzerland.
6. Annual Meeting .of the Laboratory of Tumor Cell Biology, 1995,
Bethesda, Maryland.
Структура и. обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 118 литературных источников.