Введение к работе
Актуальность проблемы
Мобильные генетические элементы, известные под названием короткие ретропозоны, или SINE (Short Interspersed Elements), представляют собой рассеянные по геномам эукариот повторяющие последовательности длиной от 80 до 400 п н, амплификация которых происходит с помощью обратной транскрипции Первые SINE были описаны более 25 лет назад Все эти годы исследования SINE интенсивно развивались, в результате чего наши знания об этих мобильных генетических элементах значительно расширились Стали в общих чертах известны механизмы их размножения, и выяснилось, что они играют важную роль в эволюции геномов и самих организмов Однако многие вопросы, в частности, связанные с путями и механизмами эволюции самих SINE остаются малоизученными
В геномах млекопитающих одного вида имеется 2-4 семейства коротких ретропозонов, каждое из которых содержит десятки или сотни тысяч копий, чьи нуклеотидные последовательности обычно обладают 65-90%-ным сходством
SINE транскрибируются РНК-полимеразой Ш, благодаря наличию в своей 5 -концевой части промотора РШС-полимеразы Ш, состоящего из двух боксов (А и В), которые разделены последовательностью длиной 30-40 п н Короткие ретропозоны относятся к неавтономным мобильным элементам, поскольку не кодируют собственных ферментов и используют для своего размножения обратную транскриптазу, закодированную в одном из видов длинных ретропозонов, или LINE (Long Interspersed Elements) Большинство SINE млекопитающих размножаются с помощью длинного ретропозонаІЛ
Наиболее распространены семейства SINE, ведущие свое происхождение от молекул тРНК, поскольку их нуклеотидные последовательности обладают выраженным сходством с тем или иным видом тРНК Однако имеются два класса SINE, чье происхождение связано с другими РНК, синтезирующимися РНК-полимеразой Ш Один из них включает несколько недавно открытых семейств SINE рыб, произошедших из 5S рРНК (Kapitonov & Jurka 2003, Nishihara et al 2006) Короткие ретропозоны другого класса (Alu приматов и В1 грызунов) были среди первых описанных SINE (Kramerov et al 1979, Krayev et al 1980, Dei nmger etal 1981,Hayneset al 1981) Они ведут происхождение от цитоплазматической 7SL РНК, имеющей длину 300 нуклеотидов и входящей в состав рибонуклеопротеидных частиц SRP (signal recognition particles) SRP участвуют в узнавании сигнальных пептидов секретируемых и мембранных белков
В процессе возникновения Alu и В1, произошла потеря центральной части 7SL РНК длиной 144-182 нуклеотидов (рис 1) Alu (300 п н ) состоит из двух таких сходных, но неидентичных последовательностей - левого (L) и правого (R) мономеров Alu были найдены в геномах всех изучавшихся в этом отношении приматов, включая полуобезьян (Prosimiae), что свидетельствует о возникновении Alu у общего предка всех приматов (Zietkiewicz et al 1998,Roosetal 2004) 7SL РНК
бокс A
^
делеция d7, d9 или d10
/ \
pB1d7minpB1d9 pB1d10
кчмщии і 1=1
Рис 1. Схема, иллюстрирующая структуру, происхождение и эволюцию элемента В1 и родственных ему SINE у грызунов У общего предка грызунов приматов и тупай произошло образование ретропсевдогена 7SL РНК, несущего делецию 182 п н, что привело к возникновению элемента рВ1 Последующая потеря специфического участка (отмечен черным) длиной 7, 9 или 10 п н привела к образованию новых семейств рВ 1 Тандемная дупликация участка длиной 29 п н привела к возникновению канонического элемента В1, известного из геномов Mas musculus и Rattus norvegtcus Образование 20-нуклеотидной тандемной дупликации в элементе pBldlO предшествовало возникновению димерных SINE (Bl-dID и MEN) у предка белок и сонь ID -тРНК-родстенный SINE, образовавший эти димерные SINE путем слияния с В1 Для последовательностей dID характерна делеция дтиной 19 п н Косой штриховкой отмечены боксы А и В промотора РНК-полимеразы III Серым цветом и точечной штриховкой помечены участки, входящие в состав тандемных дупликаций
В отличие от Alu, В1-элемент из геномов домовой мыши (Mus musa/Itm) и серой крысы (Rattus norvegtcus) представляет собой мономер и имеет длину около 140 пн Однако в эт ом элементе имеется внутренняя тандемная дупликация с размером повтора 29 п н Наличие делеции длиной 9 п н в центральной части В1 мышей - еще одно отличие В1 от Alu (рис 1) В геномах этих грызунов обнаружено небольшое число копий В1 без такой дупликации и делеции Такие копии, названные pBl (proto-Bl), рассматриваются как эволюционные предшественники Bl (Quentin 1994) В геномах мышей и крыс также
обнаружены варианты рВІ со специфической делецией длиной 7, 10 или реже 9 пн (pBld7, pBldlO и pBld9 соответственно, рис 1)
Грызуны (Rodentia) образуют самый обширный отряд млекопитающих, состоящий по крайней мере из 30 семейств (Hartenberger 1985, Павлинов 2003) Если В1 у мышей и крыс (сем Mundae) изучены сравнительно хорошо (Krayev et al 1982, Den Dunnen & Schoenmakers 1987, Bains & Temple-Smith 1989), в частности, благодаря секвенированию геномов М musculus (Waterston et al 2002) и R. norvegwus (Gibbs et al 2004), то этот SINE из геномов других грызунов остается очень мало изученным Кроме того, описано два семейства димерных SINE, содержащих в качестве мономеров В1 и Ш-родственный элемент (Ш известен как самостоятельный SINE грызунов, ведущий происхождение от аланиновой тРНК (Kim et al 1994)) Первый из них, MEN, выделенный из генома белки Menetes berdmorei, имел левый Ш-подобный мономер и В1 в качестве правого мономера (Serdobova & Kramerov 1998) Второй SINE, обнаруженный в геномах белок (Sciundae) и сонь (Glindae), имел противоположное расположение мономеров и был назван Bl-dID (Kramerov & Vassetzky 2001) Важно отметить, что В1-мономер из белок и сонь содержал внутреннюю дупликацию длиной 20, а не 29 п н как в В1 мышей и крыс (рис 1)
Недавно, используя гибридизацию с В1-зондомМ musculus, в нашей лаборатории было показано наличие 7SL РНК-родственных SINE не только у приматов (Alu), но и у грызунов всех 15 тестированных семейств, но не у представителей других отрядов млекопитающих (Vassetzky et al 2003) (Исключение составляют тупайи - отр Scandentia, несущие в своих геномах небольшое число копий В1-подобных SINE (Nishihara et al 2002, Vassetzky et al 2003)) Предварительные опыты по клонированию и секвенированию геномных фрагментов ДНК подтвердили наличие копий В1 у таких грызунов как тушканчики, мышовки, белки, бобры и морские свинки (Vassetzky et al 2003) Однако подробного систематического исследования В1, включающего большинство семейств грызунов до сих пор не проводилось
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было изучение распространенности, структуры, возможных путей и механизмов эволюции короткого ретропозона Вів отряде грызунов Для чею были поставлены следующие задачи
Оценил ь число копий Вів геномах грызунов различных семейств
Клонировать и секвенировать копии В1 из представителей большого числа семейств грызунов
Проанализировать установленные нуклеотидные последовательности В1 и выявить их специфические структурные черты Основываясь на этих чертах проанализировать филогению грызунов
Построить схему эволюции Вів отряде грызунов
Научная новизна и практическая значимость
Впервые было оценено число копий В1-элемента в геномах грызунов большинства существующих семейств Показано, что эта величина варьирует от 104 до 10б Клонировано и секвенировано более 300 нуклеотидных последовательностей В1, выделенных из геномов грызунов, относящихся к 22 семействам Обнаружен целый ряд характерных структурных черт, включающих замены, делеции и дупликации в нуклеотидных последовательностях В1 Проведенный анализ позволил систематизировать В1 и разделить их на три категории (I) канонический В1-элемент, содержащий внутреннюю тандемную дупликацию, (И) рВ1, вариант без такой дупликации, рассматриваемый как эволюционный предшественник других В1-элементов, (III) сложные SINE, состоящие из двух мономеров В1(или рВ1) и Ш-родственной последовательности Обнаружено, что у подавляющего большинства анализированных семейств грызунов каноническая В1 содержит специфическую 7-нуклеотидную делецию Впервые подсемейства SINE были использованы в качестве филогенетических маркеров Анализ структурных черт канонических В1-элементов позволил проверить обсуждаемые в настоящее время филогенетические связи между семействами грызунов В частности, были получены свидетельства в пользу базального расположения семейств сонь, белок и аплодонтий на древе грызунов Предложен новый вариант механизма образования внутренней тандемной дупликации длиной 29 п н в составе В1 Разработана схема путей эволюции В1 и родственных ему SINE
Данная работа является первым крупномасштабным исследованием структуры и эволюции короткого ретропозона в одном из отрядов млекопитающих Разработанные подходы могут быть использованы для изучения эволюции как других SINE, так и организмов других систематических групп
Апробация работы
Результаты работы были представлены на Международной Конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г), а также на ежегодных научных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2005г, 2006i )
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы, из них 3 статьи
Структура и объем диссертации