Введение к работе
Актуальность проблемы.
Осуществление международных программ секвенирования геномов, особенно таких сложных как геномы млекопитающих, стало определяющим фактором развития исследований молекулярных основ жизнедеятельности организмов. Решение задачи массированного определения первичной структуры геномной ДНК потребовало разработки новых методологических подходов и эффективных технологий клонирования, физического и генетического картирования, компьютерной обработки получаемых данных Одновременно, реконструкция полных нуклеотидных последоваїельностей геномных ДНК и накопление колоссальных объемов генетической информации, требующей дальнейшей переработки и биологической интерпретации, инициируют возникновение новых отраслей молекулярной биологии, таких как биоинформатика и функциональная геномика. Вслед за полногеномным секвенированием, изучение механизмов реализации генетической информации, дальнейшее изучение функционирования и эволюции генома как целостной биологической системы становятся приоритетными направлениями современных исследований. Например, функциональная геномика решает проблемы расшифровки систем функциональных взаимосвязей элементов генома и определения молекулярпо-гепетических механизмов его эволюции. В этой связи изучение эволюции генома человека следует отнести к первоочередным задачам современной молекулярной биологии.
Одним из наиболее драматических следствий секвенирования генома человека стало установление того факта, что около половины генома занято многочисленными копиями мобильных элементов различных типов, в то время как белок-кодирующие экзонные области суммарно составляют приблизительно 2% нуклеотидной последовательности генома Высокая насыщенность мобильными элементами, в основном ретроэлементами (РЭ), показана для геномов мыши, шимпанзе и крысы и является, по-видимому, характерной особенностью структуры геномов млекопитающих. Данные предварительного анализа структуры геномной ДНК человека позволяют предполагать, что ретроэлементы непрерывно распространялись в і еноме приматов на протяжении последних 65 миллионов лет. Считается, что свыше миллиона копий различных РЭ возникло и зафиксировалось в геномах приматов в процессе эволюции и тысячи из них, вероятно, отличают геном человека от генома шимпанзе. Хотя механизмы распространения и фиксации РЭ в геноме недостаточно изучены, а сравнительный анализ структур секвенированных геномов далек от завершения, полученные к настоящему времени данные сформировали широко принятое мнение о том, что РЭ активно реформировали геном, вызывая геномные перестройки, нарушая или модифицируя структуру существующих генов, участвуя в процессах Формирования новых генов Кроме структурных
Р0( '' "МЛЬНА*
1 -КА
?00 V
,'Г
изменений перемещения РЭ способны приводить и к изменению функциональных свойств отдельных локусов генома за счет перераспределения регуляторных элементов Так например, длинные концевые повторы (LTR) эндогенных ретровирусов (ERV) содержат множество потенциальных регуляторных элементов, узнаваемых клеточными системами регуляции транскрипции Вновь интегрированные LTR способны быть альтернативными промоторами, энхансерами, входить в состав локус контролирующих областей, или служить источником других регуляторных сигналов для окружающих генов.
Несмотря на интенсификацию исследований ретроэлементов геномов различных эукариот, накопленные к настоящему времени данные об активности РЭ в геномах приматов носят либо фрагментарный, либо, наоборот, слишком общий характер, и гипотеза о роли РЭ как универсальных регуляторов эволюции требует дальнейшего подтверждения Кроме того следует учитывать, что каждый из активных ретроэлементов, например индивидуальный LTR, может выполнять свою функцию в определенной сети регуляторных взаимодействий клетки, и его роль может существенно отличаться от роли другого индивидуального LTR, вовлеченного в другую регуляторную сеть. Поэтому для исчерпывающего анализа функционального и эволюционного потенциала необходимо знать положение в геноме всех LTR и рассматривать каждый из них в том геномном контексте, в котором он был фиксирован эволюцией после внедрения Определение эволюционной истории эндогенных ретровирусов и каждого из LTR элементов предоставило бы ценнейшую информацию об образовании видоспецифических регуляторных элементов и дало ключ к пониманию молекулярно-генетических отличий человека от высших приматов.
Таким образом, структурно-функциональные исследования эндогенных ретровирусов человека и определение эволюционной динамики их распространения в геноме являются одной из наиболее актуальных проблем современной молекулярной биологии и функциональной геномики
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлось определение эволюционной динамики
распространения и особенностей расположения в геноме эндогенных ретровирусов человека
семейства HERV-K, позволяющие выявить ряд молекулярно-генетических отличий человека
от высших приматов.
В ходе исследований решались следующие задачи-
- разработка экспериментальных методов идентификации участков интеграции ретроэлементов в составе отдельных хромосом и целого генома; идентификация, секвенирование и исчерпывающее картирование длинных концевых повторов (LTR) семейства HERV-K на 19-ой и 21-ой хромосомах человека.
проведение сравнительно-структурного анализа нуклеотидных последовательностей LTR и участков их интеграции в ортологичных локусах геномов различных видов приматов, разработка систематики LTR HERV-K и определение времен возникновения и распространения в геноме выявленных групп LTR
разработка метода полногеномного сравнительного анализа распределения повторяющихся элементов в геномах близкородственных видов и идентификация LTR HERV-K и участков их интеграции, отличающих геном человека от генома шимпанзе
- определение особенностей распределения LTR в геноме человека, определение генного
окружения LTR и составление каталога генов человека, содержащих эволюционно
недавние интеграции LTR HERV-K.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В настоящей работе сформулирована концепция об эволюционно значимых
изменениях систем регуляции экспрессии генов, возникающих в результате интеграции LTR эндогенных ретровирусов, как важной молекулярно-генетическои причине видообразования у приматов. Проведен структурно-эволюционный анализ LTR элементов наиболее функционально активного семейства эндогенных ретровирусов HERV-K и получены первые подтверждения высказанной гипотезы:
Впервые проведено полнохромосомное картирование LTR элементов, что позволило выявить новую тенденцию к концентрации LTR в обогащенных генами участках генома. В ходе выполнения картирования LTR на двух хромосомах человека были разработаны оригинальные методы и новый подход к экспериментальному сравнительному анализу распределения ретроэлементов в образцах ДНК различной сложности.
Разработана первая систематика эндогенных ретровирусов и определена эволюционная динамика распространения семейства HERV-K в геноме приматов. Выявлено несколько волн ретротранспозиций эндогенных ретровирусов, совпадавших по времени с эволюционным расхождением основных линий приматов.
По резулыатам гранзиеншой экспрессии репортерного гена показано эволюционно длительное сохранение промоторной активности индивидуальными LTR элементами генома человека В составе LTR HERV-K элементов открыт альтернативно направленный промотор.
Впервые выделена многочисленная группа LTR элементов, предположительно отличающая геномы человека и шимпанзе. Экспериментальная проверка, проведенная на основе оригинального методического подхода, подтвердила человек-специфичность интеграции свыше ста LTR HERV-K элементов
Таким образом, в ходе выполнения настоящей работы были выявлены существенные молекулярно-генетические различия двух близкородственных видов приматов и создана необходимая база для дальнейшего изучения функциональных свойств охарактеризованных LTR элементов генома человека.
Полученная информация о структуре, геномной локализации и генном окружении LTR, особенно LTR элементов, специфичных для генома человека, открывает новые перспективы в изучении регуляторних систем нормального функционирования генома человека
Разработанные методы полногеномного анализа и резулыаш струк1урно-эволюционного анализа LTR элементов генома человека, полученные в настоящей работе, могут быть эффективно использованы в широком спектре эволюционно- генетических и медико-генетических исследований
Апробация полученных результатов.
Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях' Итоговые конференции Российской программы Геном человека (1995-2001), конгрессы HUGO (1996-2001), BITS (1998, 99) - специальные конференции Министерства энергетики США (DOE US) по проблемам идентификации генов и регуляции их экспрессии, ESF Retrotransposon network (2001-03) - специальные совещания Европейского Научного Фонда по ретротранспозонам и эволюции геномов
Цикл работ по хромосомному картированию LTR и транскрибируемых последовательностей был отмечен премией им акад А А Баева(1997), результаты отдельных исследований неоднократно были включены в ('Важнейшие итоги деятельности РАН»
Публикации.
Диссертация обобщает данные 37 основных публикаций
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в формировании концепции о роли LTR элементов в эволюции генома приматов, разработке оригинальных методов для экспериментального подтверждения сформулированной концепции, обсуждении и оформлении полученных результатов Весь экспериментальный материал получен автором и руководимыми им аспирантами ИБХ РАН, за исключением экспериментов по транзиентной экспрессии репортерного гена люциферазы, выполненных совместно с сотрудниками лаборатории Е П Конанцевым, Е В. Снежковым и С Б. Акоповым.