Введение к работе
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), селективно инфицируя человеческие моноциты, макрофаги и Т-лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности С04-дифференцировочный антиген (рецептор).
Процесс связывания и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки обусловлен специфическим взаимодействием наружной субьединицы гликопротеина вирусной оболочки ВИЧ - gpl20 и Ш4-рецептора на поверхности клетки-мишени.
Способность CD4-рецептора связывать ВИЧ предполагает возможность его использования в качестве противовирусного агента при ВИЧ-инфекции. Впервые возмохность такого использования СД4 была показана в системе In vitro несколькими группами авторов. В этих работах использовались различные растворимые формы рекомбинантного белка СД4, выделенные как из про- так и эукариотических клеток. Однако, при клинических испытаниях таких препаратов сколько-нибудь значительного противовирусного эффекта достигнуто не была Тем не менее, следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как и для ряда других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении комплексного системного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления заболевания будут использоваться лекарственные средства с разными механизмами действия и их различные комбинации. Поскольку, надежных препаратов, ингибирующих стадию взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками пока нет, дальнейшее изучение воэмохности использования для этих целей различных рекомбинантных производных С04- рецептора не представляется бесперспективным.
Кроме того, различные рекомбинантные. производные Ю4-рецептора могут и успешно применяются в различных моделях для изучения механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками, для очистки и изучения вирусных белков gpl 20 и gpl 60.
Исходя из этого, нами проводилась работа по получению мутантных и др. рекомбииантных форм CD4-рецептора, которые можно было бы использовать для этих целей. Мы также пытались получить коныогаты растворимых форм CD4-рецептора с веществами белковой природы, ингибирующими ВИЧ-инфекцию в системе in vitro, для направленной доставки таких веществ в ВИЧ-инфицированные клетки.
Цели и задачи исследования
Основными целями настоящей работы были: клонирование и экспрессия в бактериальной системе кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека и получение рекомбииантных растворимых форм С04-рецептора,, способных связывать ВИЧ и вирусный гликопротеин др120 и подавлять репродукцию вируса.
В связи с этим, в задачи исследования входило:
1. Конструирование рекомбииантных плаэмид, содержащих
полноразмернуо копию кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов
человека.
2. Субклонирование фрагментов гена CD4-рецептора в бактериальных
векторах экспрессии.
-
Получение растворимых рекомбииантных форм С04-рецептора (рС04).
-
Выделение и очистка рекомбииантных гибридных белков производных CD4-рецептора из бактериальных клеток.
-
Характеристика иммунологических свойств и антивирусной активности полученных рекомбииантных белков в системе 1п vitro.
-
Изучение возможности использования рекомбииантных форм С04-рецептора для аффинной очистки вирусспецифических белков.
7. Получение мутантных форм С04-рецептора, несущих мутации в
участке узнавания гликопротеина gplZO ВИЧ
8. Получение конъюгатов CD4-рецептора с веществами, ингмбирующими репродукцию ВИЧ
Основные положения, выносимые на защиту
1. Стратегия клонирования к/ШК сена С04-рецептора и
определение ее нуклеотидной последовательности.
2. Получение растворимых рекомбинантных форм
С04-рецептора, эффективно взаимодействующих с др]20 ВИЧ и
ингибирующих в системе in vitro репродукцию вируса.
3. Синтез мутантних производных CD4- рецептора для
изучения механизмов взаимодействия CD4 с gpl20 ВИЧ и получение
клеток бактерий, экспрессирущих мутантные белки.
4. Получение коиъюгата С04-рецептора с ингибитором БИЧ
L-лизиноксидазой, что позволило значительно снизить дозы
ингибитора при подавлении репродукции ВИЧ а системе in vitro.
Научная новизна работы
В результате проведенных исследований, из библиотеки кДНК ФГА-стимулированных Т- лимфоцитов человека была клонирована кДНХ гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека и определена его нуклеотидная последовательность. Анализ нуклеотидной последовательности позволил обнаружить пять нуклеотидных замен, три из которых приводят к изменении аминокислотной последовательности.
Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие полную копко гена С04-рецептора (pNS12) и участок гена, кодирующий первые два иммуноглобулинподобных домена СС4-рецептора (pCDZ245). С помощью химического агента бромциана получена растворимая рекомбинантная форма CD4-рецептора (pCD4), содержащая первые 150 аминокислот с N-конца молекулы.
Показано, что подобно нагивному белку. pCDi взаимодействует с моноклональными антителами к С04 -и обладает зыра*%нной антивирусной активностью в опытах in vitro.
Полученные мутантные производные С04-рецептора могут бль использованы в экспериментах, по изучению механизмов патогенеза БИЧ- инфекции.
Показано, что С04-рецептор, коньогированный с - ингибитором ВИЧ-инфекции белковой природы эффективно связывается с инфицированными ВИЧ клетками и ингибирует репродукцию вируса.
Практическое значение работы
Практическое значение работы заключается в получении рекомбинантной плазмиды на основе вектора экспрессии рЕХ1, содерхащей фрагмент гена CD4-рецептора, детерминирующий синтез гибридного белка CD4-бета-галактоэидаза.
Полученные нами рекомбинантные, формы С04-реиептора могут использоваться для дальнейших экспериментов по разработке препаратов с аиитвирусным действием. Полученные белки могут такхе быть полезны для выделения и очистки гликопротеинов ВИЧ др120 и gpl60, а такхе в экспериментах по изучению биологии ВИЧ и механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками.
Публикация результатов исследования и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 14 работ и получено два патента. Результаты исследований представлены и обсухдены на VI, VIII, IX, X Международных конгрессах по проблемам СПИД (Сан-Франциско, 1990; Амстердам, 1992; Берлин, 1993; Иокагама, 1994), на советско-австралийском симпозиуме по проблемам "Профилактики и лечения СПИДа" (Москва, 1990), на 1 и 2 Нехдународных конференциях "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992, 1993), Мехдународной конференции " Молекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД" (Новосибирск, 1992).
Структура и обьем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Обьем работы составляет 121 стр. машинописного текста. Полученные результати иллюстрированы 8 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 187 наименований. -