Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Экспрессия в клетках E. coli рекомбинантных производных CD4-рецептора, обладающих анти - ВИЧ активностью Малюшова, Вера Васильевна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Малюшова, Вера Васильевна. Экспрессия в клетках E. coli рекомбинантных производных CD4-рецептора, обладающих анти - ВИЧ активностью : автореферат дис. ... кандидата биологич. наук : 03.00.03 / Рос. академия мед. наук. НИИ вирусных препаратов.- Москва, 1995.- 27 с.: ил. РГБ ОД, 9 95-2/2758-5

Введение к работе

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), селективно инфицируя человеческие моноциты, макрофаги и Т-лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности С04-дифференцировочный антиген (рецептор).

Процесс связывания и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки обусловлен специфическим взаимодействием наружной субьединицы гликопротеина вирусной оболочки ВИЧ - gpl20 и Ш4-рецептора на поверхности клетки-мишени.

Способность CD4-рецептора связывать ВИЧ предполагает возможность его использования в качестве противовирусного агента при ВИЧ-инфекции. Впервые возмохность такого использования СД4 была показана в системе In vitro несколькими группами авторов. В этих работах использовались различные растворимые формы рекомбинантного белка СД4, выделенные как из про- так и эукариотических клеток. Однако, при клинических испытаниях таких препаратов сколько-нибудь значительного противовирусного эффекта достигнуто не была Тем не менее, следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как и для ряда других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении комплексного системного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления заболевания будут использоваться лекарственные средства с разными механизмами действия и их различные комбинации. Поскольку, надежных препаратов, ингибирующих стадию взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками пока нет, дальнейшее изучение воэмохности использования для этих целей различных рекомбинантных производных С04- рецептора не представляется бесперспективным.

Кроме того, различные рекомбинантные. производные Ю4-рецептора могут и успешно применяются в различных моделях для изучения механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками, для очистки и изучения вирусных белков gpl 20 и gpl 60.

Исходя из этого, нами проводилась работа по получению мутантных и др. рекомбииантных форм CD4-рецептора, которые можно было бы использовать для этих целей. Мы также пытались получить коныогаты растворимых форм CD4-рецептора с веществами белковой природы, ингибирующими ВИЧ-инфекцию в системе in vitro, для направленной доставки таких веществ в ВИЧ-инфицированные клетки.

Цели и задачи исследования

Основными целями настоящей работы были: клонирование и экспрессия в бактериальной системе кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека и получение рекомбииантных растворимых форм С04-рецептора,, способных связывать ВИЧ и вирусный гликопротеин др120 и подавлять репродукцию вируса.

В связи с этим, в задачи исследования входило:

1. Конструирование рекомбииантных плаэмид, содержащих
полноразмернуо копию кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов
человека.

2. Субклонирование фрагментов гена CD4-рецептора в бактериальных
векторах экспрессии.

  1. Получение растворимых рекомбииантных форм С04-рецептора (рС04).

  2. Выделение и очистка рекомбииантных гибридных белков производных CD4-рецептора из бактериальных клеток.

  3. Характеристика иммунологических свойств и антивирусной активности полученных рекомбииантных белков в системе 1п vitro.

  4. Изучение возможности использования рекомбииантных форм С04-рецептора для аффинной очистки вирусспецифических белков.

7. Получение мутантных форм С04-рецептора, несущих мутации в
участке узнавания гликопротеина gplZO ВИЧ

8. Получение конъюгатов CD4-рецептора с веществами, ингмбирующими репродукцию ВИЧ

Основные положения, выносимые на защиту

1. Стратегия клонирования к/ШК сена С04-рецептора и
определение ее нуклеотидной последовательности.

2. Получение растворимых рекомбинантных форм
С04-рецептора, эффективно взаимодействующих с др]20 ВИЧ и
ингибирующих в системе in vitro репродукцию вируса.

3. Синтез мутантних производных CD4- рецептора для
изучения механизмов взаимодействия CD4 с gpl20 ВИЧ и получение
клеток бактерий, экспрессирущих мутантные белки.

4. Получение коиъюгата С04-рецептора с ингибитором БИЧ
L-лизиноксидазой, что позволило значительно снизить дозы
ингибитора при подавлении репродукции ВИЧ а системе in vitro.

Научная новизна работы

В результате проведенных исследований, из библиотеки кДНК ФГА-стимулированных Т- лимфоцитов человека была клонирована кДНХ гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека и определена его нуклеотидная последовательность. Анализ нуклеотидной последовательности позволил обнаружить пять нуклеотидных замен, три из которых приводят к изменении аминокислотной последовательности.

Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие полную копко гена С04-рецептора (pNS12) и участок гена, кодирующий первые два иммуноглобулинподобных домена СС4-рецептора (pCDZ245). С помощью химического агента бромциана получена растворимая рекомбинантная форма CD4-рецептора (pCD4), содержащая первые 150 аминокислот с N-конца молекулы.

Показано, что подобно нагивному белку. pCDi взаимодействует с моноклональными антителами к С04 -и обладает зыра*%нной антивирусной активностью в опытах in vitro.

Полученные мутантные производные С04-рецептора могут бль использованы в экспериментах, по изучению механизмов патогенеза БИЧ- инфекции.

Показано, что С04-рецептор, коньогированный с - ингибитором ВИЧ-инфекции белковой природы эффективно связывается с инфицированными ВИЧ клетками и ингибирует репродукцию вируса.

Практическое значение работы

Практическое значение работы заключается в получении рекомбинантной плазмиды на основе вектора экспрессии рЕХ1, содерхащей фрагмент гена CD4-рецептора, детерминирующий синтез гибридного белка CD4-бета-галактоэидаза.

Полученные нами рекомбинантные, формы С04-реиептора могут использоваться для дальнейших экспериментов по разработке препаратов с аиитвирусным действием. Полученные белки могут такхе быть полезны для выделения и очистки гликопротеинов ВИЧ др120 и gpl60, а такхе в экспериментах по изучению биологии ВИЧ и механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками.

Публикация результатов исследования и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ и получено два патента. Результаты исследований представлены и обсухдены на VI, VIII, IX, X Международных конгрессах по проблемам СПИД (Сан-Франциско, 1990; Амстердам, 1992; Берлин, 1993; Иокагама, 1994), на советско-австралийском симпозиуме по проблемам "Профилактики и лечения СПИДа" (Москва, 1990), на 1 и 2 Нехдународных конференциях "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992, 1993), Мехдународной конференции " Молекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД" (Новосибирск, 1992).

Структура и обьем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Обьем работы составляет 121 стр. машинописного текста. Полученные результати иллюстрированы 8 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 187 наименований. -