Введение к работе
стуалмюсть проблемы.
Прогресс в изучении генов иммуноглобулинов и регуляторных элементов, инимающих участие в их экспрессии, обусловил возможность конструирования спрессионных систем, позволяющих как исследовать отдельные элементы нкционирования генов антител, так и проводить биосинтез полноразмерной ілекульї антитела или же ее частей. Создание таких систем позволило энструировать in vitro неприродные антитела, имеющие как фундаментальное к и прикладное значение (Morrison, 1992; Norderhaug, 1997; Owens, 1994). Одной
интенсивно развивающихся областей молекулярной биологии является лучение, исследование экспрессии и свойств так называемых химерных антител, есть антител, вариабельная часть которых, как правило, имеет мышиное, а нстантная - человеческое происхождение. Совмещение в одной молекуле двух шх частей изначально было обусловлено потребностью в антителах для агностических и лечебных целей. Получение химерных антител позволяет лучше нять процессы экспрессии иммуноглобулиновых генов, а также структурно-нкциональные взаимодействия, существующие в молекуле антитела.
Химерные антитела получают в клетках эукариот, так как именно в сариотических клетках происходит гликозшшрование молекулы, корректное эрачивание (фолдинг) полипептидной цепи и образование дисульфидных свя-І, процессы, столь необходимые для сохранения и выполнения антигенсвязы-ощих и эффекторных функций антител. Прокариотические системы экспрессии обеспечивают такого посттрансляционногс процессинга молекулы.
В лимфоидных клетках имеется специальный аппарат транскрипции муноглобулиновых генов, включающий в себя транс-действующие белковые кторы, взаимодействующие с промоторами и энхансерами генов муноглобулинов, что представляет основу для экспрессии этих генов. В то же ;мя возрастающий интерес к получению рекомбинантных антител стимулирует иск новых систем экспрессии иммуноглобулиновых генов. Представляется гересным изучение экспрессии иммуноглобулиновых генов в лимфоидных и шмфоидных клетках под контролем вирусных промоторов: промотора РНК-иимеразы бактериофага Т7 и промотора цитомегаловируса человека (hCMV).
При экспрессии химерных (мышь/человек) антител внимание привлекают следующие вопросы. Во-первых, при конструировании плазмид необходимо учесть всю информацию по регуляторним элементам иммуноглобулиновых генов, обеспечивающих их экспрессию в клетках лимфоидного и нелимфоидного ряда, а именно: наличие и функционирование промоторов и энхансеров генов, сайтов сплайсинга и сайтов полиаденилирования мРНК, а также лидерных пептидов, обеспечивающих транспорт синтезированных полипептидных цепей в вакуоли цитоплазматичсского ретикулюма клетки. Во-вторых, представляет интерес изучение и сравнение секреции химерных (мышь/человек) антител в лимфоидных и нелимфоидных клетках. В-третьих, актуально наличие функциональной активности химерных антител, определяемой взаимодействием константных доменов иммуноглобулинов человека с вариабельными доменами мышиных антител. В-четвертых, в случае бицистронной транскрипции тандема генов химерных антител с промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 встает вопрос о механизме трансляции транскрибированной РНК.
Задачи и цели исследования.
Целью данной работы являлось конструирование плазмид, несущи* рекомбинантные гены химерных (мышь/человек) антител против трансферринг свиньи под контролем промотора цитомегаловируса человека (hCMV) v промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, экспрессия генов химерны; антител в лимфоидных (SP2/0) и нелимфоидных (СНО) клетках, изучение секрецго химерных антител, продуцируемых клетками SP2/0 и СНО, а также анали: антигенсвязывающей активности полученных антител.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Сконструированы плазмиды, несущие рекомбинантные гены химерны, (мышь/человек) антител против трансферрина свиньи под контролем промотор; цитомегаловируса человека (hCMV) и промотора РНК-полимеразы бактериофаг Т7. Для экспрессии иммуноглобулиновых генов в эукариогических клетка промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 использован впервые. В результат трансфекции получены клоны клеток-продуцентов, стабильно интегрировавших
геном и экспрессирующих гены химерных антител на основе лимфоидных (SP2/0) и нелимфоидных (СНО) клеток.
Впервые получена полицистронная экспрессия тандема генов химерных антител под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, обеспечивающая сбалансированный синтез легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов. Предложена гипотеза, описывающая возможный механизм трансляции полицистронной мРНК. Экспрессия под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7 может быть использована в других случаях, где требуется сбалансироваиный синтез двух полипептидньгх продуктов. Показано, что уровень секреции экспрессированных антител зависит от типа клеток.
В работе экспрессированы химерные (мышь/человек) антитела изотопа Е. Известно, что антитела IgE играют исключительно важную роль в иммунологических реакциях организма. Полученные химерные антитела изотипа Е могут представлять потенциальную ценность при изучении процессов аллергии.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на:
11-ой конференции Европейской Федерации иммунологических обществ, Хельсинки, Финляндия, 1991);
8-ом Международном Конгрессе иммунологов (Будапешт, Венгрия, 1992);
Российско-американской конференции "Catalytic antibodies and antibody mgineering" (Москва, 1993);
на ежегодной Итоговой конференции Института молекулярной биологии ш.В.А.Энгельгардта РАН (в рамках этой конференции на конкурсе научных работ института среди фундаментальных работ -1 место) (15-16 февраля 1994 г.);
12-ой Европейской конференции по иммунологии (Барселона, Испания, 1994);
Российско-германской конференции по молекулярной биологии (Кельн, РРГ, 1995).
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка сокращений и :писка литературы. Она изложена на 121 странице, содержит 14 рисунков и фотографий, 7 таблиц и 267 библиографических источников.