Введение к работе
Актуальность проблемы. Транспортные РНК занимают центральное место в биосинтезе белка, выполняя функцию адапторной молекулы, ответственной за перевод последовательности нуклеотидных триплетов в последовательность аминокислот.
В настоящее время молекулы тРНК достаточно хорошо охарактеризованы по первичной, вторичной и третичной структуре. Установлено принципиальное единство вторичной структуры ("клеверный лист") и пространственной организации (ь- конформация) различных тРНК.
Для обеспечения безошибочной реализации геномной информации тРНК разной аминокислотной специфичности, должны обладать индивидуальными особенностями структуры в пределах общейь - конфорыации.
Уникальное разнообразие химической структуры тРНК достигается благодаря присутствию в молекуле модифицированных (необычных) нуклеотидов. Наиболее распространенной модификацией полинуклео-тидной цепи является метилирование. Этот процесс катализируется рядом высокоспецифичных ферментов - тРНК-метилтрансфераз (К.Ф.2. Ї.І.). Метилазы переносят метильную группу с s -аденозил-і, -мети-онина на определенный атом одного из 4-х нуклеотидов, занимающего строго определенное положение в цепи тРНК,или на 2 -гидроксильнуга группу рибозы.
Известно, что метилирование повышает термостабильность тРНК, стабилизирует ее третичную структуру, в ряде случаев влияет на скорость аминоацилирования. Степень посттранскрипционных модификаций, в частности, метилирования тесно связана с физиологическими и патологическими процессами в клетке. Однако роль различных модификаций тРНК остается до конца не выясненной (Киселев и др., 1984, Bjork et al,1987).
Метилтрансферазы представляют собой удобный объект для изучения общих принципов функционирования олигомерных ферментов. Фермент-субстратные комплексы метилазы и тРНК являются хорошей моделью для исследования общих принципов белково-нуклеинового узнавания, а также проблемы специфичности ферментов.
Метилтрансферазы, вследствие их лабильности и сложности выделения в гомогенном состоянии, изучены относительно слабо.
Для ряда тРНК-метилтрансфераз, например, (гуанозин-2-) T.thermophiXus НВ27, (аденин-I-) T.thermophilusHB8^afleHHH-I-) и. (гуанин-Т-) печени крысы определены молекулярные массы ферментов, константы Михаэлиса и максимальная скорость реакции метилирования.
- I-
В ряде случаев достигнут успех в изучении механизмов взаимодействия метилаз и тРНК. Показано, что третичная структура тРНК играет существенную роль в метилировании ( Venkstern, 1971» Shershneva et al., 1973i Matsumoto et al., 1937). Получены данные о роли различных участков молекулы тРНК в образовании комплекса с метилазами (Гамбарян, 1980).
Данные о структуре комплексов, содержащих метилтрансферазу, о взаимном структурном влиянии фермента и субстрата при образовании комплекса в настоящее время практически отсутствуют. Изучение этой стороны вопроса представляется достаточно актуальным.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении первой стадии каталитической реакции метилирования тРНК - образования фермент-субстратного комплекса. В качестве объекта были выбраны тРНК(аденин-ї-)-метилтрансфераза Therms -thermophilus НВ8 (К.Ф.2.Ї.Ї.36) (далее метилаза) и индивидуальные тРНК дрожжей и Escherichia coli.
В задачи работы входило исследование субъединичного строения фермента и структурных перестроек молекулы белка в широком диапазоне изменений концентрации метилазы и температуры раствора (204 ТЧ90С), а также изучение стабилизирующего действия инертных белков и субстрата - тРНК на структуру фермента.
Так как исследуемый фермент выделен из экстремальных термофильных организмов, выяснялись возможные механизмы, повышающие термостабильность белка.
Дальнейшее исследование затрагивало различные аспекты комп-лексообразования метилазы и тРНК: определение констант ассоциации фермент-субстратных комплексов и числа субъединиц белка, взаимодействующих с тРНК (20 4Тб80С), термостабильность тР,НК в комплексе, изучение жесткости связывания белкового и нуклеинового компонентов и пространственной структуры фермент-субстратных комплексов.
Задачи работы включали также исследование влияния фермента на вторичную и третичную структуру тРНК при образовании комплекса. Изучался один из принципиальных вопросов о возможном восстановлении высшей структуры тРНК при взаимодействии с метилазой в интервале температур, превышающих температуру плавления тРНК (^80).
Научная новизна и практическая ценность работы. Проведен детальный анализ четвертичной (субъединичной) структуры тРНК(аденин-ї-)-метилтрансферазы Thermus thermophilus НБ8 С использованием ря-*да флуоресцентных и других оптических методов. Показано, что фермент имеет лабильную субъединичнуга структуру. В зависимости от концентрации белка в растворе и температуры (20 4Т470С) в состав молекулы метилазы входит от одной до 8+2 субъединиц, фермента одинаковой молекулярной мессы (25000).
Определена область критических концентраций белка (< 20мкг/мл^ или 8*10 М субъединиц), в которой олигомеры метилазы диссоциируют на субъединицы. Следствием этого процесса является уменьшение удельной активности фермента»
В области 70 4Т 4 90С обнаружен кооперативный переход молекул белка в крупные ассоциаты, размер которых (а ) по данным интенсивности рассеяния УФ-света а~320 нм. В присутствии тРНК размеры образующихся ассоциагов d«260+320 нм. Ассоциация метилазы, по-видимому, является одним из механизмов, повышающих термостабильность фермента. Этот результат имеет .общее значение для термофильных белкоз. В последнее время аналогичные данные получены для глутаминовой синтетазы экстремального термофила Bacillus caldolyticus (Merkler et al., 1988).
Разработан флуоресцентный метод определения относительного изменения степени спиральности нуклеиновых кислот в свободном состоянии и в комплексе с белками в средах, сильно' рассеивающих УФ-свет при высоких температурах (70-80С). Метод основан на измерении квантового выхода флуоресценции, .константы связывания и кажущегося числа мест связывания бромистого этидия на двухцепо-чечных участках нуклеиновой кислоты.
С помощью разработанного метода впервые показано стабилизирующее действие лабильной субъединичной структуры фермента по отношению к субстрату. Структура тРНК остается стабильной при температурах, превышающих ее температуру плавления, только при образовании комплекса с 3 и более субъединицами фермента. Активными являются комплексы, молекулярная масса которых равна 100-170 кДа.
С помощью поляризованной флуоресценции бромистого этидия впервые показаны конформационные изменения в структуре тРНК при взаимодействии с ферментом. Добавление активного белка к расплавленной при 80С'тРНК^ дрожжей приводит к ренатурации ее двухспиральных участков. Эффект восстановления высшей структуры специфичен по отношению к природе РНК.
Полученные результаты способствуют поиску аналогичных закономерностей лабильной четвертичной структуры белков (стабилизирующая, восстанавливающая) у других ферментов.
Разработанный метод и подходы, приманенные в данной работе для изучения взаимодействия тРНК и тРНК-ыетилазы, могут быть с успехом использованы для исследования различных бвлково-нукдеиновых комплексов, в особенности при высоких температурах в рассеивающих свет средах.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Симпозиуме с участием стран-членов СЭБ и СФРЮ "физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" (Дущино, 1985J, У1 Всесоюзном симпозиуме по конформационнкм изменениям в биополимерах и растворах (Тбилиси, 1985), на конкурсе научных работ молодых ученых ИМБ АН СССР (1986J, на 111 Симпозиуме "Равновесная динамика структуры биополимеров" (Пуцино, 1987), У Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, 1987ja на конкурсе научных работ МБ АН СССР(1987).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав литературный обзор, материалы и методы, экспериментальные результаты, обсуждение результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на -///"страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 7 таблиц. Список литературы включает S