Введение к работе
Актуальность проблемы.
Для ДНК человека и млекопитающих известна одна эпигенетическая мутация -метилирование цитозина по пятому положению в составе динуклеотида CpG Важность ее для развития организма подтверждается несколько десятков лет, но к настоящему моменту окончательно не выяснены механизмы ее функционирования
На сегодняшний день подтверждено, что распределение метилированных цитозинов в геномной ДНК, так называемый паттерн метилирования, наследуется в ряду клеточных поколений и имеет видовую и тканевую специфичность Также известно, что метилирование ДНК задействовано в аллельно-специфическом импринтинге, сопровождает инактивацию интегрированных экзогенных последовательностей и инактивацию генов онкосупрессоров при канцерогенезе Известны белки, отвечающие за приобретение паттерна метилирования в эмбриогенезе и поддерживающие его в дальнейшем онтогенезе Для ряда случаев доказана взаимосвязь между метилированием ДНК и другими эпигенетическими факторами, но неизвестно какая из этих модификаций является определяющей в реорганизации структуры хроматина Показано, что для некоторых генов существует корреляция между транскрипционной активностью и метилированием ДНК их регуляторних последовательностей Также известны метил-связывающие белки, которые взаимодействуют с факторами и трансфакторами транскрипции Однако на данный момент утверждение о роли влияния метилирования ДНК на транскрипцию генов остается не до конца аргументированным
Таким образом, несмотря на большой объем данных о метилировании ДНК, остается пробел в знаниях о том, каким образом информация, записанная в виде паттерна метилирования ДНК, интерпретируется в определенные сигналы, отражающиеся на жизнедеятельности клетки
Как правило, исследования метилирования ДНК направлены либо на его локальное изучение в районе одного гена, либо они проводятся на уровне всего генома В первом случае изучается зависимость транскрипционной активности гена в разных тканях от уровня метилирования его промоторной области Подобные исследования заранее ограничены изучением конкретного гена и не проводится широкомасштабного геномного картирования метилированных CpG сайтов в протяженных (несколько млн по) геномных локусах, содержащих помимо генов многочисленные различные регуляторлые элементы Объектом исследований метилирования полного генома обычно являются CpG-островки или промоторные области генов всего генома, или отдельных
хромосом Примером такого подхода являются исследования в рамках амбициозного международного проекта Human Epigenome Project (www epigenome org), целью которого является идентификация и каталогизация всех эпигенетических вариаций человеческого генома в норме и различных патологиях Поскольку эпигенетическая характеристика чрезвычайно вариабельна, лабильна и меняется в течение жизни одного индивидуума, конечная цель этого проекта будет достигнута еще очень нескоро Кроме того, методы полпогеномного анализа в силу сложности изучаемых эукариотических организмов не могут претендовать на всеобъемлимость результатов
В этой связи чрезвычайно важным представляется подробный анализ метилирования протяженных полигенных участков генома, включающий в рассмотрение как CpG-островки и регуляторные области, так и отдельные CpG сайты, расположенные в кодирующих и межгенных областях Изучение паттерна метилирования для ДНК разных тканей и при разных заболеваниях дает возможность проанализировать его роль в совокупности со многими другими факторами - структурой хроматина, распределением генов и различных регуляторных последовательностей, повторяющихся элементов и др Однако на сегодняшний день не предложено экспериментальных подходов, позволяющих изучать метилирование ДНК в протяженных геномных участках
Таким образом, для изучения функционального значения метилирования, в частности, механизмов влияния метилирования на экспрессию генов, необходим комплексный подход, в котором рассматривается не один конкретный ген, а протяженный полигенный район, содержащий гены, псевдогены, различные повторы, локус-контролирующие районы, инсуляторы и другие регуляторные элементы Поэтому чрезвычайно важным является получение данных, детально описывающих статус метилирования протяженных областей Анализ корреляции множества факторов, проведенный на таком полигенном уровне в разных тканях, в том числе опухолевых, может позволить делать статистически достоверные выводы о функциях метилирования в регуляции транскрипции в протяженных районах ДНК Разработке такого подхода посвящена данная работа
Пели и задачи работы
Целью данной работы являлось создание нового экспериментального подхода для изучения тканеспецифического метилирования протяженных геномных участков (млн по)
Были поставлены следующие задачи
-
Разработать метод, позволяющий изучать распределение метилирования в протяженных участках ДНК
-
Используя разработанный метод, провести сравнительный анализ метилирования участка 19-ой хромосомы в ДНК нормальных и опухолевых тканях, а также клеточной линии
-
Провести функциональный анализ найденных дифференциально метилированных локусов, для чего сравнить состояние хроматина и уровень экспрессии генов, находящихся в этих локусах
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработан новый метод для изучения метилирования ДНК на протяженных геномных участках, который дает информацию о статусе метилирования CpQ динуклеотидов вне зависимости от их расположения относительно кодирующих и регуляторных областей Разработано две модификации метода для картирования как неметилированных CpG сайтов (1), так и гиперметилированных геномных участков (2) Подтверждена высокая специфичность и чувствительность этого метода, который на сегодняшний день позволяет анализировать участки генома длиной до нескольких миллионов п о
Метод был использован для получения распределения неметилированных CpG сайтов для различных нормальных и опухолевых тканей человека в полигенном локусе 19 хромосомы FXYD5 - С0Х7А1 размером 1,02 млн п о Этот локус является модельным объектом для построения полной функциональной карты регуляторных цис-элементов на полигенном протяженном геномном участке, проводимого в Лаборатории Структуры и Функций Генов Человека (ИБХ РАН) В результате выполнения работы впервые получены подробные эпигенетические карты этого локуса Сравнительный анализ полученных карт выявил минимальные различия между паттернами метилирования данного локуса в двух типах опухолевых тканей (семинома и рак легкого) и соответствующих им нормальных тканях Исключением является участок, содержащий гены СОХ7А1, SCAP и CAPNS, который гипометилирован в нормальной ткани по сравнению с опухолевой Показано, что транскрипционная активность указанных генов выше в нормальной ткани по сравнению с опухолевой
При анализе распределения неметилированных CCGG сайтов в локусе FXYD5 -СОХ7А1 для ДНК клеточной линии А549 (аденокарцинома легкого) идентифицированы один гипометилированный и два гиперметилированных протяженных ген-содержащих
участка, каждый длиной 30 тыс п о Анализ состояния хроматина и транскрипционной активности генов в одном из гиперметилированных участков показал, что метилирование промоторных областей не играет основной роли в репрессии транскрипции соответствующих генов
Разработанный метод может быть применен в фундаментальных исследованиях в области молекулярной биологии и медицины для решения широкого круга проблем, связанных с эпигенетической регуляцией генома, а также для практического применения в медико-генетических целях, в частности, для поиска диагностических маркеров различных патологий, а также терапевтических мишеней
Структура диссертации.
Данная диссертация изложена на -^ листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего' '"ссылок