Введение к работе
Актуальность проблемы. Биодеградация целлюлозосодержащего
сырья является одной из основных задач биотехнологии. Наиболее
изучены ферменты, участвующие в деградации целлюлозы и гемицеллю-
лозы, в частности - ксилана, у грибов, так как уровень их экс
прессии значительно .выше, чем у бактерий. Однако бактериальные
целлюлазы и ксиланазы, особенно ферменты термофильных бактерий,
имеют ряд преимушеств с точки зрения их применения в биотехнолоп
гии: более высокая удельная активность ферментов, термостабиль
ность, меньшая степень ингибирования конечными продуктами гидро-
. лиза. Из- .
вестно, что некоторые представители вида .Thermotoga продуцируют высокотермостабилъные ксиланазы, которые представляют потенциальный интерес для целлюлозо-буманной промышленности, так как способны обеспечить экологически чистый процесс отбеливания бумаги, заменяя хлорную кислоту. Продукция этих ферментов в самом микроорганизме, как правило, довольно низкая. Клонирование генов тер-мостабильньк гликозил-гидролаз в мезофильных микроорганизмах, в частности - в клетках Е. coll, и использование методов генной инженерии позволяют значительно увеличивать уровень экспрессии этих ферментов и-упрощает способ их получения, "очистки и изучения.-Данная работа посвящена клонированию генов термостабильных ксила-наз и целлгалаз экстремально термофильной эубактерии Thermotoga neapolitana и исследованию структуры и функции высокотермоста-бильной ксиланазы ХупА.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было клонирование генов термостабильных целлгалаз и ксиланаз экстремально термофильной эубактерии Thermotoga neapolitana в клетках Е. coll и исследование структуры и функции термостабильной ксиланазы ХупА.
В.ходе работы решались следующие задачи:
создание и анализ банка генов Т.neapolitana в клетках E.coll;
отбор индивидуальных клонов с различной субстратной специфичностью;
определение нуклеотидной последовательности клонированного гена ксиланазы ХупА; '
исследование структуры и функции фермента:
изучение физико-химических свойств термостабильной ксиланазы. Научная новизна и практическая значимость работы. Из клоноте-
ки T.neapolltana было отобрано и охарактеризовано по субстратной специфичности 8 индивидуальных клонов, продуцирующих 1.4-р-глюка-назу, ламинариназу. две различные ксиланазы и четыре 1,4-р-глюко-зидазы. Был отобран клок, продуцирующий высокотермостабильную р-ксиланазу ХупА и локализован фрагмент1ДНК T.neapolltana, определяющий синтез данного фермента. Определена нуклеотидная последовательность гена хупа. На основе анализа нуклеотидной последовательности и выведенной из нее аминокислотной последовательности ХупА был сделан вывод, что ксиланаза А представляет собой белок с молекулярным весом 119323 Да. Сравнительный анализ гомологии аминокислотной последовательности данного бежа с последовательностями уже охарактеризованных гликозил-гидролаз и известные особенности третичной структуры данных ферментов позволили выделить в составе ксиланазы ХупА лидерный пептид и три домена (центральный каталитический домен. С-концевой целлюлозосвязывающий домен и N-концевой домен, о функциональном значении которого почти- ничего не известно), разделенных короткими линкерными последовательностями. Делеционный анализ подтвердил предположения, что средний домен является каталитическим, С-концевой домен является целлюло-зосвязьюающим -доменом, N-концевой домен обеспечивает термоста-бильность данного белка/ Термостабільная ксиланаза А из рекомби-нантного штамма E.coli DH5ct, содержащего плазмиду рТТ17, очищена до гомогенности по данным, электрофореза в ПААГе и определены ее основные физико-химические характеристики. На основании анализа субстратной специфичности и основных продуктов гидролиза ксилана ксиланаза A T.neapolltana охарактеризована, как эндо-1.4-(5Ч)-кси-лан ксилогидролаза (КФ 3.2.1.8). Показано, что ХупА является наиболее термостабильной из известных на сегодняшний день 'ксиланаз эубактерий.
Апробация работы. Результаты исследований" докладывались на международном симпозиуме по биотехнологии -"Protein engineering and structural biology" (Miami. USA. 1995), на VII Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1994), а также на ежегодной научной конференции Института молекулярной генетики РАН (Москва, 1995,1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введе-