Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ Честухина, Галина Георгиевна

Введение к работе

Актуальность темы.

Внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культ.;р неизбежно требует расширить применение микробиологических средств защиты растений в связи с проблемой охраны окружающей среды. Установления партии и правительства "О совершенствовании научного эбеспечения развития агропромышленного комплекса страны" (І987Г) И "О «эренной перестройке дела охраны природы в стране" (1988) подчеркивают їеобходимость тщательного изучения л внедрения биологических методов !эщиты сельскохозяйственных и лесных культур от вредителей.

Микробиологические средства защита растений обладают высокой щецифичностью ентомоцидного действия, поражая строго определенные вида іасекомнх и не оказывая отрицательного эффекта на окружающую среду, [рименение микробных энтомоцидных препаратов ке вызывает резистентности насекомых, они безоп&:лш для людей, животных, растений.

Среда микробиологических средств защиты растешій важное место от-одится ентомопатогенным бактериальным препаратам. К группе энтомопато-енных, так называемых кристаллообразующих бактерий, относят культуры ac.tharlnglenats, Bac.sphaericus, Bac.popilllae, которые в процессе поруляции образуют в клетке кристалловидные включения белковой природы. Ведущей группой бацилл, продуцирующих внтомодадные кристаллы , яв-яется Bac.thurlnglensls (ВТ). Вид ВТ делится на 32 подвида на основании азличий в биохимических свойствах вегетативной клетки. Дельта-эндоток-ины, образующие кристаллы, у разных подвидов ВТ различаются по специ-ичности внтоМоцидного действия , поражая насекомых отрядов Lepldoptera, Iptera, Coleoptera.

В нашей стране внтомопатогенные бактериальные препараты стали ие-зльзовать около 25 лет назад и в настоящее время мощности по производ-гву биологических инсектицидов на основе ВТ достигают десятков тыс. экн. Интенсивное использование микробных инсектицидов требует научного 5еспечения бактериологического метода защиты растений.

Несмотря на столь важное практическое значение бактерии ВТ отно-ітельно мало изучены,в физиолого-биохимическом отношении, особенно го относится к характеристике основного фактора патогенности - белко-)му кристаллообразующему дельта-вндотоксину, который.В дальнейшем для >аткости мы будем называть просто эндотоксином. Тек, к началу данной іботн было только известно, что кристаллы, продуцируемые разными подвиги, несколько отличаются по форме и размеру. Сведения о белковом >ставе кристаллов были крайне противоречивыми, не было единой точки

зрения на размеры молекул эндотоксинов, отсутствовал сравнительний анализ физико-химических свойстр. вндотоксинов из разных подьидов ЬТ, отличающихся по специфичности антомоцидного эффекта.

Токсичность
Подвид серотип lpldoptera Dtptera Coieopter

Цель и задачи исследования:

Цель данной работы - изучение структурной организации а функциональных свойств широкого круга эндотоксинов ВТ.

Для ее решения били намечены следующие этапы работы: установление Зелкового состава ентомоцидних кристаллов, образуемых разными подви-іами ВТ; выяснение роли эндогенных протеиназ при оценке белкового состава кристаллов и разработка способов их инактивации на основе изучения 5йзико-химических и функциональных свойств ферментов; разработка мето-(ов выделения эндотоксинов (протоксинов) и истинных токсинов;выявление іазличий между ендотоксинами на основании анализа мол.массы, изучения нтигенных свойств и сравнения триптических пептидов; изучение молеку-:ярной организации ендотоксинов методом ограниченного протеолизэ; уста-овление элементов первичной структрм у ряда вндотоксинов с разной спе-ифичностью действия; изучение структурной организации истинных токсинов а примере эндотоксина подвида ALE; выявление одновременной продукции гаммами нескольких эндотоксинов с разной специфичностью и оценка роли того факта в определении спектра внтомоцидной активности препаратов.

Научная новизна и практическая ценность, впервые:

Установлена молекулярная организация дельта-эндотоксинов ВТ, кото-іе, как показано в данной работе, у большинства подвидов представлены ілками с Мг около 130000, построенными из одной полипептидной цепи.

Показано, что N-концевая половина молекулы эндотоксина существует в іде устойчивого к протеолизу N-домена, ответственна за биологическое >йствие и соответствует истинному токсину.

N-домен имеет субдоменную организацию и формируется Из двух глобул, зко отличающихся по первичной структуре.

Предложена гипотеза структурно-функциональной организации ендоток-нов, как цепи доменов, из которых аминоконцевой выступает как собст-нно токсин, следующий за ним - как "узнающий" рецептор домен, а С-кон-вая половина молекулы важна, еидимо, для поддержания белка в раство-мом состоянии.

Получены данные, указывающие на существенные различия в первичной руктуре у дельта-вндотоксшгов, резко отличающихся по специфичности томоцидного эффекта (эндотоксины подвидов 0AL,BTI).

Показана одновременная продукция рядом штаммов нескольких эндотокси-в, отличающихся по первичной структуре и биологической активности.

Выделены и охарактеризованы внеклеточные протеиназы ВТ(сериновэя п галлопротеиназа). Установлена принадлежность ссриновой протеиназы к

особой группа тиолзавиеимих протеинзз в семействе субтилизшюв.

Сравнение сериновых тиолзависимых протеиназ, образуемых разным] подвидами показало, что их изменчивость значительно меньше, чеі изменчивость соответствующих эндотоксинов.

Полученные данные прояснили молекулярные основы функционирования а; дотоксішов, что обеспечило базу для направленного создания генно-инжене; ними методами штаммов-продуцентов эндотоксинов с заданными свойствами.

I. БЕЛКОВЫЙ СОСТАВ КРИСТАЛЛОВ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ ВТ.

Цротеиназы ВТ и их бдияяие }<а энтолоцидкые белки при растворении кристаллов.

К началу данной работы (1975г) в литературе имелись весьма противоречивые данные о белковом составе кристаллов эндотоксинов, продуцируемых, как штаммами разных подвидов ВТ, так и штаммами одного подвида. Более того, исследователи передаю расходились в оценке белкового состава кристаллов одного и того же штамма. Так, число компонентов в кристаллах, по данным разных авторов, варьировало от одного до шести, еще более значительными были расхождения в оценке молекулярной массы главных компонентов - от 370000 до 1500.

В связи с этим на первом месте стояла задача установления истинного белкового состава кристаллов и его сравнительного анализа для различных подвидов и штаммов ВТ. Изучение Оелкового состава кристаллов ВТ было на чато с характеристики эндотоксинов, формирующих кристаллы подвида З'Ш шт.Insectus.

Кристаллы ВТ растворяются в жестких условиях - при рН >12, а в при сутствии тиоловых реагентов - при рН 8-9- Иногда, как в случае кристаллов штамма Insectus, для растворения требуется добавление денатурирующих реагентов (мочевина, гуанидин). Растворение кристаллов тт.Insectus при совместной обработке 8М мочевиной и 10 Ш ДТТ (рН 8,5) приводило к появлению в растворе нескольких белковых компонентов (Мг от 145000 до 80000), обнаруживаемых с помощью влектрофзреза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (Рис.1). Увеличение времени растворения с одного до 12-48 ч при 37 способствовало накоплению в растворе компонентов меньшей мол.массой (около 80000). При растворении кристаллов теми і реагентами, но при 100, практически весь белок концентрировался полосе, соответствующей белку с мол.массой около 145000.

Мы предположили, что при относительно мягких условиях растворен; (20-37), несмотря на присутствие денатурирующих реагентов, происход: ограниченный гидролиз внтомоцидного белка примесными протеиназами.

!Ч*1

Рис.1 Влияние примесных протеиназ на основные белковие компоненты кристаллов подвида THU (шт.Insectus) при разных способах растворения.

й а г t

Электрофорез в 5% полиакриламидном геле в присутствии SDS. Кристаллы растворяли : а)при рН 12; б) в р-ре 8М мочевины и ІОмМ ДТТ, рН 8,5 при 20 ! ч; в) также как "б", но при 37 48 ч; г J также как "б", но при 100 2 мин; д) также как "в", но в присутствии ФМСФ.

ействительно, при растворении кристаллов шт.іпзесіиз при 20, но в рисутствии ингибиторов сериновых и металлог.ротеиназ (<ЙИСФ и ЭДТЛ) в астворе обнаруживался преимущественно компонент с Mr 145000.

Был сделан вывод, что кристаллы шт.Insectus построены из одного асокомолекулярного белкового компонента , а множественность наблюдаемых ри електрофорезе белков отражает действие примесных протеиназ на сходную молекулу эндотоксина при растворении, поскольку денатурация элкового субстрата способствует его протеолизу.

Природа сорбированных на кристаллах протеиняз была определена с по-эщыо специфических хромогенних пептидных субстратов, синтезированных в ашей лаборатории Л.А.Люблинской, и специфических ингибиторов. В репаратах кристаллов подвидов THU(viT.lnsectU3) и GAL{mi.612) обнаружена ктивность по субстрату сериновых протеиназ - Z-Ala-Ala-Leu-pNA и вталлопротеиназ - DNP-Gly-Gly-Val-Lys.

Очевидно, что присутствие в препаратах кристаллов протеодаттичееких зрментов , различие в соотношении протеиназ разтшх классов,обнаруженное разных штаммов, разница в условиях растворения белков (присутствие гнатурируотих агентов, время обработки, температурный режим) -все эти акторы могут существенно влиять на протеоліз и тем самым на характер и эотношение выявляемых в кристалле белковых компонентов.Это в значительна мере объяснило причину противоречивости литературных данных об енто-опатогенных белках ВТ.

Опыт работы с эндотоксинами позволяет сделать общий вывод о эобходимости тщательного контроля за протеолизом при работе со всеми елками, особенно в условиях, приближающихся к денатурирующим.

Разработка спосойоб выделения белковых нолпонешоь \

из кристаллических тел включения.

В конце процесса спорообразования ЬТ происходит лизис спорангиев в культуральной жидкости оказывается смесь спор, кристаллов и обломков клеточных оболочек.

Для выделения кристаллов был применен подход, основанный на различии физико-химических свойств поверхностей частиц. Ми модафициров ли метод Pendleton(1969).основаіщцй аа использовании двуфазной систе - 1% сульфат натрия-кеилол, заменив сульфат натрия водой. Такая модифи кация дала возможность получать кристаллы из разных подвидов ВТ, выращенных на среде, содержащей 0,5% трипказина, 0,4% дрожжевого экстракта 0,5% глюкозы,- 0,5% NaCl, 0,05% CaClg, 0,01% MgS0₄, с чистотой более 99

Расщепление ендотоксина примесными протеиназами, происходящее при растворении кристаллов, требовало найти способ удаления и инактивации протеолитческих ферментов.

Поскольку образование кристаллов совпадает с началом споруляции вполне вероятно, что синтезирующиеся в вто же время внутриклеточные фе менты ВТ(см.раздел 9) могут захватываться кристаллами в процессе их сборки. На поверхности уже сформировавшегося кристалла могут сорбироваться внеклеточные протеиназы. Еще одним источником протеиназ могут оказаться обломки клеточных оболочек. Действительно, при отделении последних с помощью центрифугирования суспензии кристаллов(при 4000 об мин, 4 мин) содержание протеиназ снижается.

Наиболее эффективным способом освобождения кристаллов от протеолитически активных примесей является кислотная денатурация протеиназ. С етой целью суспензию кристаллов, предварительно промытых Ш NaCl, выдерживали при рН 2,0 и 20 в течешіе 3 ч, а затем промыва водой. Очевидно, выдерживание в Ш NaCl вызывает десорбцию протеиназ, инкубация при рН 2,0 .инактивирует ферменты, неустойчивые в кислой ере (см.раздел 9).

Действенным способом инактивации протеиназ оказалась гермоденатурация при 100 в процессе растворения кристаллов в буфе (рН 8,5). содержащем 8М мочевину и \% меркаптовтанол.

В литературе известен метод выделения эндотоксинов, минуя стада получения чистых кристаллов. Он основан на избирательной экстрам, белка кристаллов из споро-кристаллических смесей меркаптосоединени? при рН 9,5-10,5 или щелочью (рН >12). Однако, в етом случае, г. наличии спор и обломков клеточных оболочек, особенно велика опасное протеолиза исходного белка примесішми протеиназами. '

Ми перенесли способ растворения кристаллов при одновременной эрмоденатурации протеиназ, оправдавший себя при работе с препаратами істьіх кристаллов, на споро-кристаллические смеси и назвали его методом горячей экстракции". Опыты с акристаллическими мутантами показали, что ж этих условиях дополнительно экстрагируется лишь Оелок споровой 5олочки с Mr 12000.

Разработанный способ выделения неповрежденного эндотоксина шосредственно из автолизата культуры микроорганизма предоставляет грокие возможности для сравнительного изучения белкового состава зисталлов одновременно у большого числа штаммов ВТ, что важно и может іть использовано при проведении генетико-селекционных работ.

Установление истинного белкового состава кристаллов

ряда подвидов ВТ.

Белковый состав кристаллов 50 штаммов, относящихся к 20 подвидам ' был проанализирован в основном методом "горячей екстракции" іоро-кристаллических смесей.

У большинства проанализированных штаммов при електрофорезе в 5% >лиакриламидном геле в присутствии SDS видна только одна полоса, гатветствующая белкам с Мг 1Э0000, 135000 или 145000 (Табл.1). >стоверность обнаруженных небольших отличий в мол.весах ендотоксинов 1зных гатаммов доказана при анализе смесей указанных белков.

Таблица I Белковый состав кристаллов разных подвидов ВТ

Вместе с тем, было отмечено, что штаммы подвида 0А1, имеют более сложный белковый состав - некторие из них содержат два (Иг 135000 і 130000) или три белка(1351ХЮ,130000 и ьЬ0и0).Из двух - трех белков построены кристаллы ряда штамм.'* ii'i'l (см. раздел 5).

Таким образом, применив инактивацию протеинаэ при растворени: кристаллов, мы впервые, уже в 1979г, показали, что кристаллически включения различных подвидов ВТ построены в основном и высокомолекулярных белков (Ыг около 130000).

Большинство из изученных нами штаммов продуцировало кристаллы содержащие белок(белки) с одинаковой мол.массой ( 130000, 135000 или 145000).Вместе с тем, обнаружение у подвида GA1 штаммов, в состав кристаллов которых входят одноврмешю несколько (до трех) отличающихся по мол.массе белков, давало основание предполагать, что такая множествошюсть ондотоксиков может встречаться и у других подвидов ВТ и не была выявлена нами только в связи с относительно ограниченны числом проанализированных штаммов.

Обнаруженные нами различия мол.массы изучаемых белков могли быть следствием внутриклеточного процессинга эндотоксина в процессе ег биосинтеза. Однако, нельзя было исключить, что речь идет о белках продуктах разных структурных генов.

Сравнение антигенных свойств эндотоксинов.

Ранее неоднократно предпринимались попытки использовать дг сравнения вндотокинов ВТ иммунологические метода анализа (Krywienozyk, 1971, Pedleton,. 1968). При втом установлено, что ендотоксини, образуем! рядом подвидов ВТ, имеют по меньшей мере один общий антиген и, следовг тельно, в определенной мере сходны. В то же время обнаруживались и аита гены, свойственные белку-эндотоксину того или иного подвида.

Методом двойной радиальной иммунодиффузии нами были охарактеризов; ны антигенные свойства эндотоксинов из 21 подвида ВТ. Кроличьи внтитео получены к ендотоксинам 7 подвидов - THU (шт. Insectua), АШ (шт. 1225 PEN (шт. 1227), йШшт.П-67 И ендотоксини с Mr 135000 и 130000 1 шт.612), З'НО(шт.НбЬ), Ь'П (шт.2395) и РЛК(шт.1124).

Установлено, что с кроличьими антителами против ендотоксині подвидов Al її DEN дают реакцию эндотоксины 12 из 21 подвергнутой сравнению подвида (Табл.2). Следовательно, многие подвиды ВТ продуциру ют антигенно близкородственные ендотоксини, существование которых пока зано такзке Lynch (1907) при анализе с помощью кроличьих антител проти

Таблица 2 Антигенная характеристика эндотоксинов разных подвидов ВТ

Подвид штамм Антигенные группы

G r;

А В В

A,B,C,D,E,F - ендотоксини, образующие полосы преципитации с антисывороткой к раствору ендотоксияов подвидов А(шт.1225), М1,<шт.11-67У, ТИП(шт. insectus), ГН0(шт.1166), BTI(шт.2395) и РЛК(1124) соответственно. X - ендотоксини, не дающие иммунной реакции ни с одной из использованных антисывороток.

ввдотоксина подвида KUH (шт-HD-l-D). Эта группа близкородственных эндотоксинов в дальнейшем рассматривается нами как группа kurstaki.

Эндотоксины некоторых подвидов - ЧИЮ,Ї'Ш,CAN,GAL, 1'НО, ВЇ1, РАК, ТОЙ, KUU, 1'ОС, WSH, SHO - не образуют полос преципитации с антисыворотками к ендотоксинам подвидов АЪЕ и DEN (Табл.2).

Таким образом, среди вндотоксинов ВТ, наряду с большой группой an тигенно и, следовательно, структурно родственных: белков, встречаются ендотоксини| первичная структура которых может существенно отличаться с эндотоксинов группы kuratakt.

Эндотоксину подвидов THmun.insectus), ЗїЧ(шт.2395), САЦшт. 11-67) ЇЇЇО(шт. Пбб), Л1Я(шт.І124) не только резко отличаются по антигеннь свойствам от ендотоксинов группы кигзіа&і, но не сходни и между собой так как не образуют преципитата с кроличьими антителами прота готерологичных эндотоксинов.

Есієє детально изучены антигешшые свойства ендотоксинов подви/ GAL, штаммы которого продуцируют кристаллы, отличающиеся по белковок составу (см.раздел I).

Показано, что раствор кристаллов шт.И-67 не реагирует с антитела*, к ендотоксинам подвидов ALE и DEN и,следовательно, кристаллы етого штаь ма образуются белками, иммунологически отличными от ендотоксинов груша kurstaki. Как бцдо установлено в дальнейшем (см.раздел 6), кристаллы шт.11-67 формируются, двумя белками с одинаковой мол.массой (130000), которые отличаются по антигенным свойствам не только от указанной группы, но и между собой (образуемые ими полосы преципитации с антите-телами к исходному раствору кристаллов етого штамма дают перекрест).

Эндотоксин подвида GAL с Мг 135000, формирующий кристаллы шт. 16 і 73, не реагирует с антителами к ендотоксинам шт.11-67, но образует поле су преципитации с антисыворотками к ендотоксинам подвидов ALE и DEN и, таким образом, серологически близок ендотоксинам группы kuratakt. Зті штаммы, содержащие только белок с Mr 135000, не токсичны для гусениц Gallerla mellonella, объекте, чувствительном только к токсинам подвида GAZ. Вероятно, специфическая активность етого подвида связана с продуі цией эндотоксина(ов) с Мг 130000.

В кристаллах шт.696 подвида GAL одноврменно присутствуют по меньшей мере два антигена (выявлены две полосы преципитации с антисыворот-. кой к белкам шт.612). Один из них родственен ендотоксинам грул киз-stakl, а другой - белкам шт. 11-67 подвида GAL.

Сложный белковый состав характерен и для ряда штаммов других подвидов ВТ. Так, раствор кристаллов шт.1252 подвида UUH дает полос:

іреципитации с кроличьими антителами против нескольких антигенно отличных эндотоксинов (шт. II-67 подвида GAL, mr.lnsectus подвида РШ, шт. 1225 подвида ALU) и, невидимому, продуцирует не менее трех эазных белков-эндотоксинов.

Таким образом, эндотоксины, продуцируемые не только разными юдвидами, но. даже и разными штаммами одного подвида существенно сличаются по антигенным свойствам. Наиболее распространены среди юдвидов ВТ эндотоксины антигенно родственной группы kwstakl, в то зремя как другие типы ендотоксинов продуцируются только определенными юдвидами. Выявление в растворе кристаллов некоторых штаммов ВТ іескольких антигенов указывает на возможность одновременной продукции іескольких разных эндотоксинов.

Оценка голологии первичной структуры экзотоксинов подвидов ALE U GAL.

К началу 1980 г никаких прямых данных о различиях первичной структуры эндотоксинов разных подвидов ВТ не было. Правда,, косвенно об этом свидетельствовали результаты иммунологических исследований втих белков, выявленные нами небольшие различия мол.массы у ендотоксинов, а также об-іаружение у подвида ВТІ эндотоксина с необычно низкой Mr - 28000.

Не было ясно, как велики могут быть ети различия, связаны ли они с вменениями первичной структуры или вызваны лишь процессами поеттранс-чящюнной модификации. Не было ответа на вопрос, сосредоточены ли амя~ гокиолотные замены в отдельных участках полипептидной цепи, например, на ;е Й- или С-конце, или распределены по всей первичной структуре.

Мы попытались оценить степень гомологии аминокислотных последовательностей этих белков, выбрав для этой цели два эндотоксина, которые различаются по мол.весу {подвид ALE - I350OO, подвид GAL - 130000),по антигенным свойствам и по специфичности энтомоцидного эффекта. Мы полагали, что используемый обычно для сравнения протеолитических гидролйза-гов белков метод "отпечатков пальцев" окажется в нашем случае непригод-чым из-за большой длины цепи (около 1300 остатков) и образования очень глажной смеси пептидов. Ввиду этого, для фракционирования триптических пептидов нами била -применена хроматография на катионообменнике Cliromo-beads с последующим разделением полученных фракций тонкослойной хроматографией на микрокристаллической целлюлозе. Для более надежной идентификации сходно расположенных зон на пластинках, мы экстрагировали пептида, зодрржащиеся в выявленных зонах, и определяли их аминокислотные состав.

В идеальном случае, для сравнения триптических гидролизатов двух

белков потребовалось би выделение всех образовавшихся пептидов. Однако отот путь слишком трудоемок. Примененный нами подход значительно прощ полного разделения пептидов,однако, его возможности ограничены прежд (сего тем, что разделение методом тонкослойной хроматографии даж одинаковых по пептидному составу фракций может дать нескольк различающиеся результаты из-за частичного перекрывания зон Следовательно, примененный метод имеет тенденцию к переоценке различий составе гидролизатов. Для того, чтобы оценить, насколько указанны ограничения метода сказываются в реальных условиях эксперимента, был проведены по два параллельных опыта с разделением одинаково получении триптических гидролизатов белка кристаллов подвида ALE (шт.1225) и GA (шт.I1-67). . Обнаружено большое сходство профилей елюции дву гидролизатов одного и того же белка (Рис.2) и почти полное совпадени хроматограмм соответствующих пиков (Рис.Э). Для двух параллельных опыто с белком из штамма 11-67 был сделан аминокислотный анализ 58 зон (28 зо в одном и 30 зон в другом опыте). В 14 случаях аминокислотный соста попарно сравниваемых зон практически совпал, т.е. обнаружено 50

f «о "" ^гм ш фрвгаия і

Рис.2 Профили влюции триптических гидролизатов вндотоксщюв со смол

Chromobeads. А и Б - два параллельных опыта для гидролизата белк

кристаллов из подвида GAL (шт.1J-67), В - опыт с гидролЛзатом белк
кристаллов из подвида ALE.

^{D п п п п П П П}

7? 'І tf-QC fit too fui-іСе 'Са-кч v#-«J *зс ffC isitio n*-tsa т-ітв ft?-w

І щ Щ jq pi fe ь--4 t; s ^ s

r?V/ /0« W-p/ tQ-tOT ter-ffl fliWJ^ -Jf /W іЩ-tVi *SS-*l f/V-W -f/ffffS

ECUG2C ППрПО

TS-tt »4*0 31-tfS J7--53 <04*i* HT '71 "32 ИГ *<т<5-/ *їб 'ві '61-'TO '?ЇЧ2 *А0-ЇОО 110-710

E.3. Тонкослойная хроматография фракций, собрашшх при разделении ішітических гидролизатов белка кристаллов на колонке со смолой tromobeads. А, Б и В - относятся к тем ке опытам, что и на рис.2. Цифры іозначают Ш пробирок, содержащих анализируемую фракцию.

«падения. Очевидно, что 50 совпадения (вместо теоретически ожидаемых Ю%) есть мера той переоценки различий между белками, которую следовало идать от использованного метода.

Аминокислотный состав зон, полученных при разделении белка из под-іда ALE, сравнивался с анализами, полученными в каждом из двух опытов белком штамма 11-67. В обоих случаях получено только 10 совпадения.

Сопоставление наблюдаемых процентов совпадения (10 вместо 50 при гзлизе заведомо одинаковых белков) указывает на существенное различие іавниваешх последовательностей. Малое 'гасло сходных зон говорит о том, о различия не локализованы в каких-то отдельных участках последователь->сти, например, в дополнительном участке, имеющемся у белка кристаллов ідвида ALE, полипептидная цепь которого несколько длиннее, чем у белка металлов шт.!1-67. Несомненно, что аминокислотных замен в последова-льности белков много и они разбросаны по всей длине полипептидной цепи.

Таким образом, еще в 1982 г нами впервые получены данные, указнваю-'е на резкие структурные отличия между некоторыми эндотоксинами ВТ, корне будучи несомненно родственными белками, тем не менее значительно ізошлись в процессе еволюции, что, вероятно,диктовалось необходимостью -дстройки под разных хозяев. Эти результаты . были подтверждены через

несколько лет при анализе первичной структуры рада аидотоксинов, установленной прочтением соответствующих структурних генов.

Известно, что белок кристаллов (дельта-вндотоксин) являетсі протоксином, поскольку он поражает гусениц только при попадании і организм насекомого с пищей. Протоксин активируется с образование! истинных токсшюв ферментами кишечішка гусениц (близких по специфічності трипсину и химотрипсшу) .

Для получения и выделения истинных токсинов нами были выбраш ендотоксини трех подвидов ВТ {'Ши -шт.Inaectus, ЛІК и GAL) максимальні отличающиеся между собой по ряду параметров - мол.весу, иммунологическш свойствам, первичной структуре и специфичности ентомоцидного еффекта.

Установлено, что ферменты разной специфичности, в том числі трипсин, химотрипсин, проназа, властаза, субтилпзин ВРН', внутриклеточн, сериновая протеиназа Bac.amylolyquefacierw, ферменты кишечника гусени: Gallerla mellonella неизменно гидролизуют все ендотоксини до фрагмента с Иг около 70000, что свидетельствует о наличии в структуре бел» стабильного домена. Фрагменты такого же мол.веса били обнаружен Sommervile (19Э1) в трилтических гидролиззтах рзстворов ендотоксино подвидов TOL, TUU, DEN.

Были основания полагать, что стабильный домен с Мг 7000 соответствует истинному токсину. Действительно, фрагменты таког мол.веса, выделенные из трилтических гидролизатов эндотоксина подвид СА1(шт.11-67, см. раздел 6) и ALE сохраняют всю биологическую актнвност и специфичность действия исходной молекулы протоксіша, причем первый и них токсичен для гусениц Galleria mellonella не только при введении ег с кормом, но и при иъецировагаш в гемоцель, что характерно только дл истинного токсина.

Для получения истинных токсинов были подобраны условия, которые способствовали исчерпывающему гидролизу протоксіша до фрагментов с И около 70000.Известно, что белки кристаллов склонны к агрегации. Наь показано, что таким свойством обладают и низкомолекулярные фрагменты и (в еще большей мере) стабильные домены. В связи с втим для иолучеш истинных токсинов, причем сохраняющих биологическую активность, і отделяли от низкомолокулярных пептидов с помощью гель-фильтрации в растворе 2М Had (при выделении истинных токсинов подвидов GAL и Т01) и в растворе 2М KSCH (при выделении домена подвида ALE).

Проведенный нами анализ показал, что N-коицевой аминокислотой

тротоксинов подвидов GAL, ALE, TOL, TUU и у соответствующих им зтабильных доменов является 'метионин. Полученные результаты совпали с данными Bulla (1981) для протоксина подвида Я/Я и выделенного из него фрагмента с Мг 68000.

Эти данные дали основание полагать, что при протеолизе фисталлообразующих белков расщеплению подвергается С-концевая часть голипептидной цепи и, следовательно, в образовании стабильного домена гчаствует N-концевая половина молекулы.

Следует отметить, что приопределегата N-концевой последовательности ' истинного токсина подвида ALE в качестве аминоконцевого вместо іетионина обнаружен остаток изолейїиша. Вероятно, такое различие ібусловлено разными способами растворения кристаллов (при рН 12,5 или 1,5 в присутствии меркаптанов). Скорее всего, растворение кристаллов гри 12,5 вызывает частичную денатурацию белка, в результате которой ітановится доступным и отщепляется трипсином N-концевои пептид.

Действительно, нами было показано, что при рН 11,5 происходит [8СТИЧНОЄ изменение третичной структуры эндотоксина етого подвида - в (елочной среде молекула претерпевает конформацйонный переход с точкой олуперехода при рН 11,2.

Методом автоматического секвенирования по Эдаану была определена оследовательность первых 29 аминокислотных остатков истинного токсина одвида ALE, которая оказалась идентичной структуре вндотокеїтов группы urstakl (см.раздел 6), начиная с 29 аминокислотного остатка.

Таким образом, при образовании истинных токсинов одновременно с граниченным протеолизом шарнирного участка, соединяющего этот N-домен с -концевой половиной молекулы, может избирательно отщепляться оследовательность из 28 аминокислотных остатков с аминного конца, что е снимает биологической активности.

Выявлены некоторые различия в свойствах N-доменов втих подвидов -азная чувствительность к гидролизу субтилизином BPN' и растворимость.

Как видно из Табл.Э, аминокислотный состав вндотоксинов протоксюгов) сходен и согласуется с литературными данными для ндотоксинов других подвидов.

Выделенные истинные токсины по аминокислотному составу в основном ходны с протоксинами. Вместе с тем, во всех истинных токсинах по ерав-ению с исходными протоксинами резко понижено содержание остатков изина. Компенсаторное накопление в втой части молекулы остатков аргини-а возможно имеет определенное физиологической значение и связано с низким значением рН в кишечнике гусениц (рН 9-И). При втих условиях

Таблица З-Аминокислотный состав протоксинов (П) и истинных токсинов (Т) ВТ. (число остатков на 100)

П Т П Т Т(0К) Т(ГО

Аминокислота 130000 65000 І350ОО 70000 65000 650С

ТОЇ TOL ALE ALE GAL GA1

могут оставаться заряженными только гуанидогрупгш аргинина.

Мевду собой истинные токсины, К8К и соответствующие протоксшш, аминокислотному составу существенно не отличаются. Следует, одна отметить, что в связи с болыюй мол.массой изучаемых белков да незначительные на первый взгляд различия могут отражать дово.г существенную разгшцу меікду бе лісами, что и было впоследствии подте ждено при установлении их первичной структуры.

Истинные токсины трех изученных подвидов отличаются по содержат остатков мотиошша. - по 5 остатков обнаружено в молекулах N-доменс

подвидов ALE и GAL и 7 остатков - у истинного токсина подвида TOL. Мы сравнили размеры фрагментов, полученных после расщепления BrCN N-доме-нов указанных подвидов. При этом все фрагменты из BrCN гидролизата истинного токсина подвида GAL отличались по мол.массе от фрагментов из N-доменов подвидов ALE и TOL, которые,в то же время, имели три фрагмента с равной мол.массой. Эти результаты свидетельствовали о различии в положении по крайней мере некоторых остатков метіїогаша в полипептидных цепях истинных токсинов из разных подвидов и еще раз подтверждали предположение о существовании различий в первичной структуре изучаемых белков.

Проведенные исследования впервые показали, что истинные токсины соответствуют стабильным к протеолізу доменам, В образовании которых принимает участие N-концевая половина молекулы протоксинов. N-домены из разных подвидов отличаются по ряду свойств и первичной структуре.

4. СТРУКТтійЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИСТИННОГО ТОКСИНА ПОДВИДА ALESTKALE).

Установление элелентов первичной структури. Для изучения первичной структуры истинного токсина подвида ALE осуществляли глубокий гидролиз эндотоксина субтилизшюм BPN'. Эндотоксин предварительно денатурировали 0.05М NaOH в течение часа при 37. После гидролиза субтилизином (при рН 10,5 в течение часа) были получены фрагменты с Мг Порядка 10000. Эти фрагменты были выделены из суммарного гидролизата гель-фильтрацией на колонке с еефадексом 0-75 в ценатурирукщих условиях (7М мочевина, 1 SDS, ІмМ ДТТ).

Для установления первичной структуры фрагменты с Мг 10000, не разделяя, гидролизовали трипсином. Несмотря на го, что выделение Етрагмеитов проводили в денатурирующих условиях, для полного их расщепле-яя трипсином оказалась Необходимой дополнительная денатурация фенолом, іто свидетельствует о высокой стабильности структуры этих фрагментов.

Чтобы разделить смесь триптических пептидов была применена хроматография на ионообмешшке Chromobeads с последующей дочисткой некоторых із 47 полученных фракций с помощью ЁЭЖХ на колонке с обращенной фазой (С._а) в градиенте концентрации ацетонлтрила.

Было получено 4Q хроматографически чистых пептидов, которые были :еквенированы по Эдману микрометодом Chang(l983) И на автоматическом :еквенаторе.

Сравнительный стсииэ сцщокислатных послеообшгелъностей

триптичесісих пептиаоб истинного токсина поббийа АШ и

первичной структури эндотоксинов noobuoa KUH. Ко времени установления нами аминокислотных последовательностей триптичеоких пептидов N-домена подвида ALE била опубликована (Schnepf, 1935) полная первичная структура эндотоксина подвида ЯІІН, определенная прочтением соответствующего структурного гена (штЛШ-1-D).

Опираясь на гомологию с последовательностью этого эндотоксина нам удалось расставить в структуре часть триптических пептидов эндотоксина подвида ALE (Рис.4)

Вместе с темі для девяти пептидов ми не нашли гомологии в последовательности эндотоксина KUH HD-1-P. Шесть из них оказались идентичными последовательности эндотоксина из другого штамма этого подвида (HD-73), установленной чуть позже Adang (1985), также в результате секвевирования соответствующеvo структурного гена.

Сравнение структуры двух эндотоксинов подвида KUH и эндотоксина подвида ALE показало, что у всех ендотоксинов аминоконцевая четверті молекулы (остатки с I по 346) отчетливо гомологичны, встречаются толькс единичные замены. Так, при сопоставлении эндотоксина подвида ALE ее структурами обоих эндотоксинов подвида KUK обнаружено только 5 замен среда 151 поддающегося сравнению остатка. Следовательно, эта часть молекулы у всех трех токсинов весьма консервативна.

Вторая четверть молекулы (остатки 347-617) вариабельна у все; токсинов , причем на етом отрезке сосредоточено 9С# всех замен, обнаруженных в структурах эндотоксинов HD-1-D и HD-73 (подвид KUfi).

С-концевые половины ендотоксинов RD-1-D и HD-73 (около 60! остатков) почти идентичны.

При внимательном рассмотрении структуры вариабельной четверт; ендотоксинов, где заменено 50% аминокислотных остатков, выявлен неравномерное распределение замен, которые группируются в вид нескольких участков длиной от 7 до 3! остатка. Всего обнаружено Э таки вариабельных последовательностей (346-358, 369-375, 379-407, 430-465 476-486, 498-525. 537-558, 563-610). Между этими блоками, последовательности ендотоксинов HD-1-D и НЬ-73 идентичны.

Из 116 аминокислотных остатков, идентифицированных в етом район последовательности токсина подвида А1, только 59 или 50 идентичи остаткам в последовательностях обоих ендотоксинов подвида КУК, т.є приходятся на идентичные последовательности эндотоксинов HD-1-D и HD-7 между вариабельными блоками. 54 аминокислотных остатка из триптичєскі

пептидов эндотоксина подвида ALE входят в последовательности, строго соответствующие структуре либо одного, либо другого эндотоксина подвида ШН.

Таким образом, при сравнении последовательности вариабельного участка ендотоксина подвида ALE и эндотоксинов подвида KUR сохраняется тот же весьма высокий уровень аминокислотных замен, который наблюдаетсл и при сопоставлении токсинов подвида KUR Между собой.

КТО HD-1-D rffiNNHTIHEOIPiHCLSHPBVEVLQaERIBTayTPIDISLSLTQPLLSEP
ALE IETGYTPIDISLSLTQFLLSSy

KUR HD-73 ffi>HNPNirJECIPYNCLSHPEVEVLGGSRIETGYYPIDISLSLTqFLLSBF

KUR HD-1-D VTGAGFVLGLVDnWGIFGPSqWDAFPVqiEqLIHQRIEEFARNQAISRL

ALE XPGAGFV fflyqiEqLIHQ

KUR HD-73 VTGAGFVXGLTOIIWaiFGPSQWDAfjg/QIEqLINQRIEEFARHQAISRI/

101
KUR HD-1-D EGLSNLYQIYAESFREWEADPTr!PALREEMRIQFttDMH3ALTTAIPLLAV
ALB EGLSDLYQIYAEAFR PTNPALREMR _

KUR HD-73 EGLSIILYQIYAESFREffEADPTIIPALREEMRIQFHDIMSALTTAIPIgfVV

KUR HD-1-D QKYQVTLLSTYVQAANUJLS'/bRDVSVPOQRQGFDAATlrrSRYUDLTRbl
ALS GQR YNDLTRLI

KUR HD-73 QlfYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDySVFGQRQGFDAATIHSRYimLTRLI

KUR HD-1-D GIfYTDYAVRWYNTGLERVWGFDSRDimiYWqFRRELTLTTLDIVAIiFSNY
ALS GSYTDYAVRffYHTGLERVWGPDSRDWVRYHQFR _ _

KUR HD-73 GirYTDYAVR\YYI!TGLERyWGPDSRDffTRraQFRRELI0TVLDIVALF|{rr

251
$Lf* HD-1-D DSRRYPYRTVSQLTREIYTIfPVLEriFDaSFRGWAQfllEQHIRQPHLMDIL
АЬІ @YPYRTVSQLTREIYTNPVINFDGSFR(^QRIEdI[rn_

KUR HD-73 DSRRYPYRTVSQLTREIYTHPVLEHFDaSFRt^JAcglE^jrRlfHXIffilL

301 KUR HD-1-D HSITIYTDVIffiGFlIYWSGHqlTASPV-GFSGPEFAFPLFGtrAaHAAPPy^Ii;

ALE _ _ _ _ __ AAPRQRll

KUR HD-73 HSITIYTI@m(@Yl»S5Hqi^3CTGFSGPEF^FI@^^HAAPg3RIj

vaqic;

VAQI' 400

KUR HD-1-D -^MGLGIFRTLSSPLYRRIILOSGPNNqBlJVLDGTEFSl&SLTTJS
ALE „_ ..._ ,

y|/yTLS^YR#-l^i№l^WLDa!rEIJAY0I-3SFGgt'|

KUR HD-73

KUR HD-1-D TIYPqRGtVDSLDTlPPQDNSyPPRAGFSHR-LSHYTM-LSqA-AOAVyr

|S!tti_ „ „ „ aaFOTR-bSKvfidM'^Kmsi: vpil

)Afra^iTVDSLr^CPPQ^|r/FPB(jgF3HR-LSWJ^^RH}FSH3qYpiJ

ALE """* '

KUR HD-73

KUR HD-1-D LRAPTFSWqH-nSAEFrrailPSSqiTQIPLTKSTMLOSaiSVVKOPaFTa

ALE [ТЙАРМРфЫ311ВР ___ ,___ .. ISPGPTG

KUR HD-73 ^lAP№S^i;-RSAEFimi]03giXTqil0Icg№l|g8-SV||GPGF!ra

KUR HD- 1-D QDIIilRTSPi5QISTmvtnTAPI.SQ—^: RYRVRIRYASTTHLQFHTSI

ALS GDTLnBTSPQQISTLRyMIJAFl-SO RYRVKYRYASTT ,

KUR НВ-7Э GI)^;pj^flHIQ^rptlp^^tiFPSTSOfoYRVl^lYA^r|PIHIiTOiW]

541 KUR HD-1-D DGRPIIKlGNPSATMSSGSNLqSGSPRTVGFTTPFKFSNGSSVPTIiSAHVF

A T F*

ІПГН HD-73 |GNaSJi|ra^ifnMMJ^U^

591 КТО HD-1-D KSGNEVYTDRIEFVPAEYTPEAEYDIERAQKAVHELFTSSKQIGIKTDVQ?

KUR HD-73 [SGTA^tD)|g^l{lj^^4^^Ab^J3RAQKAVl^?a^iQMLK'I^r

Pitc.4. .Аминокислотная последовательность триптическил пептидов ендотоксине подвида ALE в сравнении со структурами вндотоксинов подвида KUR (KD-1-D и HD-73).

Эти аминокислотные замены сгруппирована по меньшей мере в трі протяженнее вариабельные участка (346-353, 438-450, 498-525).

На участке 346-358 аминокислотная последовательность эндотоксина подвида ALE совпадает со структурой токсина HD-73 и в то же времі полностьи, за исключением трех остатков (Ш 350. 354. 356), отличается с последовательности эндотоксина IID-1-Di причем многие замены аминокислот

345 KUR HD-1-D РРУЬУ-Б1л{Т;ЛЬ{п ALE

PQQHIVAQLGQaVYil

EUR HD-74

PQQHIVAQiGQGVYR

приводят к радикальному изменению аминокислотного остатка (J* 347, 34В 353, 355, 357).

Такой же характер изменений наблюдается и на участке 438-450, гд< токсин подвида AIM воспроизводит последовательности токсина HD-73 включая и вставки (остатки 438, 443).

ШМ-Р

HD-73

UJLSaAAGAVYT—IJR MERSGF2KSSVS1IR MERSGFStJSSVSITR

Напротив, участок последовательности эндотоксина подвида ALB 498-52 идентичен последовательности эндотоксина HD-1-D (воспроизводится да» деления 521-525).

497 __

KUR HD-1-D IDILRRTSPQQISTLRVNITAPLSQ R

KUR HD-73 Cpv|^iiy^raiQf^|ji^IHFPSTSIJR

Кроме вариабельных блоков аминокислотных остатков, совпадающих с последовательностями либо эндотоксина HD-1-D, либо HD-73, В структуре ондотоксина подвида ALE обнаружены последовательности (три пептида), свойственные только ему. Два из втих триптических пептидов удалось локализовать в структуре опираясь на гомологию с опубликованной Thome (1986) структурой еще одного эндотоксина подвида KUR (шт.ШЫ). ' 390

KUR HD-1-D

KUR HD-73

KUR HD-1

FASLTTNfilPSTIYJR

YGT-SSMI PSfitaJH

OL С^Г^ГО

Этот участок последовательности у эндотоксинов можно рассматривать как гипервариабельный.

Один из пептидов (LWGMTDYAFGR) ендотоксина подвида ALE локализвать пока не удалось. Возможно, он соответствует структуре каких-то других, пока еще не изученных 'эндотоксинов ВТ или же является специфическим только для токсина данного подвида.

К настоящему времени установлена полная структура трех эндотоксинов подвида KUR и ендотоксина подвида THU{тт.Berliner), относящихся к внтигеїшо родственной группе kuratakl. N-концевая половина молекулы у всех этих белков образуется двумя структурно резко отличающимися эбластями - консервативной и вариабельной.

одо Вариабельная обл. ^у

„q Консервативная обл
KUR HD-1-D і :

KUH HD-73

CZ27S

:НШНЕВНБЕНШ- Б&Ш-Н

: гп-га-шс-всиїніз

ТШІ (Berline J

KUH HD-1

^юнюшюдапзсзс:

Рис.7 Структурная организация N-доменов эндотоксинов группы kuratakl.

Вариабельная часть молекулы может представлять собой (как в случае эндотоксина подвида THU (шт.Berliner) структуру, объединяющую последовательно части вариабельной области эндотоксинов HD-1-D (остатки 347-454) и вндотоксина подвида iUIR HD-73 (остатки 455-640).В случае елдотокеинов подвида ALE и подвида KUR (HD-1), кроме последовательностей характерных для ендотоксщюв HD-1-D и HD-73 . в структуре встречаются участки, специфичные только для эндотоксинов ALE и HD-I.

Такое неравномерное распределение аминокислотных замен в последовательности N-концевых доменов, а также их своеобразная блочность, позволяют сделать предположение о функциональной значимости этих половин, тем более, как нам удалось показать, они обладают выраженной пространственной автономией.

Доленная организация истинного токсина подвида ALE.

Консервативную и вариабельную области истинного токсина подвида ALE удалось получить в виде фрагментов с Mr 30000(или 5000) и 33000, соответственно^ результате ограниченного протеолиза субтилизином BPN" вндотоксина, подвергнутого предварительно денатурвции в мягких условиях (рН 12,5 в течение 10 мин при 37). Фрагменты с такой же мол.массой образуются при гидролизе вндотоксина подвида KUR (HD-1-D).

фрагменты из субтшшзшювого гидролизата вндотоксина подвида ALE были выделены гель-фильтрацией на сефадексе G-200 в денатурирующих условиях (Рис.6).

Установленная последовательность 10 аминокислотных остатков т N-конце фрагментов с мол.весом 30000 и 5000 - LYQIEQLINQR, былг локализована в структуре по гомологии с последовательности вндотоксинов подвида jffifi, начиная с остатка it 77. Следовательно, оба еті фрагмента соответствуют консервативной области истинного токсина і отличаются только протяженностью структуры на карбоксильном конце .

Аминоконцевую последовательность фрагмента с мол.весом ЗЗООС установить не удалось, что, возможно, связано о присутствием на егс N-конце остатка глутамина, который способен циклизоваться і пироглутаминовую кислоту. Однако, установлено, что этот фрагмент содеркиг все остатки лизине, имеющиеся в составе истинного токсин; (Табл.4). А так как известно, что у всех истинных токсинов подвид; KUR остатки лизина локализованы только в вариабельной области, мокнс предполагать, что фрагмент с мол.весом 33000 соответствует подобно! (вариабельной) части в структуре вндотоксина подвида ALE.

*280

O.S

400 МЛ

,-2-

68 «Лл-* 45 ьіа —

"*>»*-

SiM"-

Рис.7 Гель-Фильтрация на колонке с сефадекеом 0-200 {2,5x83 см) субтилизинового гидролизата эндотоксина подвида ALE (А). Колонка уравновешена 4М мочевиной, 1% SDS, І мМ ДТ1, 1мМ ЭДТА, рН 8,6. На влектрофореграмме (В) -выделяемые фракции

I (Mr 33000) и 2 (Mr 30000).

Субтшшзлн

_І

H 30000 Ц 33000 1Н~Ї5ГИІ5ГН"75ГЬГЇ5П

T5DDTT

i 30000 J | 33000

Рис.9 Схема протеолиза субтилизином БРН' ендотоксине подвида AVE посла инкубации последнего при рН !2,5 В течение 10 мин при 37.

Таблица 4. Аминокислотный состав истинного токсина и высокомолекулярных фрагментов вндотоксина подвида АШ

Субтилизин

Г"гог) 8

і і II І і І . і N J і І И І 1-І зоооо Н ззооо И~Ї^И~Ш--Г7б7И~Г5Г

USD rmy-to'A

дотзвьы mimF**—

Рис. 7 Схема протеолиза оубтилизипом 8PN' вндотоксина подвида v после инкубации последнего при рН 12,5 в течеіше 60 мин при 31

Каждая из выделенных фрагменте!» (Mr 30000, 25000, ЗЗООО) под действием субтилизина ВРИ' гидролизуется до фрагментов с Mr около 10000. Фрагменты с такой же мол.массой были получены и выделены нами ранее после гидролиза субтилизином исходной молекулы вндотокеинэ, подвергнутой предварительно глубокой щелочной денатурации.

Локализация фрагментов с МгЮООО в структуре молекулы, представленная на Рис.7, дана с учетом распределения по последовательности триптических пептидов, полученных при 'гидролизе этих фрагментов (см.Рис.4). В консервативной области можно допустить наличие двух фрагментов. Вариабельная область, вероятно, организована в виде трех фрагментов с мол.весом около 10000, из которых С-концевой неустойчив при гидролизе субтилизином, так как из этого района не было выделено ни одного Триптического пептида.

Таким образом, консервативная и вариабельная области структуры истин ного токсина подвида ALE существует в виде автономных субдоменов, каадый из которых в свою очередь организован из нескольких доменов.Можно полагать, что такая молекулярная организация характерна для эндотоксинов ряда подвидов ВТ, во всяком случае для всех ендотоксинов группы kuratakl.

Воаложюя функциональная значилоспь консервативного и вариабельного

Ооленов в структуре истинных токсинов группы kurataki.

Хорошо известно, что ендотоксини разных подвидов ВТ различаются по специфичности энтомоцидного эффекта для личинок отряда Lepldoptera.

Как видно из данных Таблицы 5» составленной нами по литературным Ванным, ендотоксини подвида KUR (HD-1-D и HD-73) и ALE отличаются по токсичности для ряда видов гусениц.

Таблица 5-

Токсичность эндотоксинов подвидов KUR fHD-1-D и HD-73) и ALE для

гусениц различных видов.

Эндотоксин Bombyx Trlchoplusla Hellothls Plodta Inter Ostrlnia
mort n'l vlrescena punctella nubllalie

*W?HD-1-D +--+ +

Ш HD-73 -+ + +

Можно предположить, что вариабельная половина молекули истинного токсина ответственна за узнавание в кишечішке чувствительных насекомых соответствующих рецепторов, которые могут существенно отличаться. Ьероятно, различия в ентомоцидном действии етих трех токсинов обеспечивают вариабельные участки последовательности истинных токсинов. Обнаруженная вариабельность структури и, что особенно важно блочность аминокислотных замен, позволяют объяснить возможность подстройки структуры вндотоксішов под биологические особенности различных видов гусениц.

Консервативная по структуре Ы-концевая половина молекулы истинного токсина .видимо, является той частью молекулы протоксина, которая ответственна за неизвестный пока механизм непосредственного токсического действия.

Таким образом, ендотоксини подвидов А1 и KUR и, вероятно, все ендотоксини, относящиеся к антигешю родственной группе kurstakl, сходны не только структурной, но и функциональной организацией молекулы. Все они имеют С-ковцевую половину молекулы, которая подвергается протеолизу при образовании истинного токсина и не существенна для внтомоцидногс действия. В истинном токсине (N-домене) существуют два большиз функциональных района, осуществляющих узнавание мишени (вариабельная область) и собственно токсическое действие (консервативная область).

Подвид ВТІ, открытый в 1977 г, резко отличается от других подвида! ВТ специфичностью ентомоцидного еффзкта - он поражает личинок многих видов отряда двукрылых {Diptera) и не токсичен для личинок Lepldoptera.

Кристаллы, образуемые штаммами втого подвида по дашшм разных авторов содержат, как правило, белок с Мг 8000, а также белки большей мол.массы(130000 и 70000), относительное содержание которых в кристалла; варьирует у разных штаммов BTI.

При растворении кристаллов ВТ1(шт.2395) в присутствии Д1Ф и ЭДТА і растворе в сопоставимых количествах присутствовали белки с Мг 130000, 70000 и 28000. Однако, после предварительной кислотной обработки кристаллов(наиболее действенного способа инактивации примесных протеина: содержание в растворе белка с Mr 70000 резко уменьшалось, что не билі связано с ухудшением его растворимости.

Был сделан вывод, что кристаллы BTL (шт.2395) сформированы двумя ендотоксинами (Mr 130000 и 28000), а белок с Ыг 70000 , по аналогии с ендотоксинами других подвидов ВТ, является продуктом протеолиза первого

Г>7

из них и соответствует его стабильному N-концевому домену.

Эги белки различаются по растворимости, что позволяет разделять их с помощью избирательной екстракшш различными растворителями. Например, белок с Мг 28000 переходит в раствор в присутствии 8М мочевины при рН 7,0. После обработки кристаллов соляной кислотой (рН 2,) растворимость белка с Мг 130000 ухудшается, в результате чего 0,05М Na-карбонатным буфером (рН 10,0), содержащим ІОмМ ДТТ, акстрагируется сначала белок с Mr 28000, а затем в 0.05М' NaOH растворяется белок с Mr 130000.

Белки BTI с Mr 130000 и 70000 отличаются от ендотоксшюв других подвидов ВТ повышенной чувствительностью к протеолитическому расщеплению. Аминокислотный состав белка с Мг 28000 (Табл.6) сходен с опубликованным Tyrell (1981).

Белки с Mr 130000 и 70000 по аминокислотному составу близки белкам соответствующей мол.массы (протокеинам и истинным токсинам) из других подвидов ВТ. Вместе с тем, обращает на себя внимание возрастание, по сравнению с ендотоксинами других подвидов ВТ, содержания лизина, как в исходной молекуле, так и у белка с Мг 70000. Эта закономерность подтверждена в последующем при анализе аминокислотных последовательностей ряда белков BTI - Mr 134000 (Ward,1988), Mr 127500 (Sen, 1988), Mr 72Э57 (Donovan, 1988), Mr 70000 (Thome, 1987 ),установленных прочтением соответствующих структурных генов.Действительно, в обоих белках BTI с Мг около 70000 и в N-кошдевой половіте молекулы белков с Mr 130000 содержится около 30 остатков лизина, в то время как у вндогокеинов группы kursta&l - только четыре. Низкое содержание лизина компенсируется у последних возрастанием числа остатков аргинина (до 50), У эндотоксинов BTI с Mr 70000 содержание обеих основных аминокислот в N-концевой половине примерно равное, а у ендотоксине Mr 134400 число остатков аргинина в три раза меньше, чем лизина.

В связи с втим в кишечнике личинок при рН 10 молекула ендотоксинов группы kurstakt будет сохранять исходный положительный заряд, в то время как у эндотоксинов BTI общий положительный заряд молекулы уменьшится. Если учесть содержание в ендотокетшах отрицательно заряженных групп, то оказывается , что молекула ендотскскнов группы kuratakl будет при рН 10 иметь нейтральный заряд, в то время как ендотоксгаш BTI - отрицательный. Возможно, такое распределение заряженных аминокислот в молекулах обеспечивает определенную функциональность - например, формирование на поверхности молекулы отрицательно заряженных участков, важных для взаимодействия с соответствующими рецепторами в эпителии кишечника насекомых.

Автоматическим методом Эдмана определена последовательность 16 вмн-

Таблица 6. Сравнение аминокислотного состава белков кристаллов BTI (шт.2395) и вндотоксинов из других подвидов ВТ (число остатков на 100)

Бедки (Мг)
Аминокислота 28000 70000 J 30000 70000 130Q00
BTI BTI BTI ВТ ВТ

нокислотных остатков N-концевых участков белка с Mr 28000 и 70000.

Впервые показано, что аминоконцевая последовательность белка ВИ с Иг 28000 не имеет структурного сходства с ендотоксинами группы kuratakt. Полная первичная структура, установленная впоследствии секве-нированием ооответствуицего структурного гена, подтвердила правильность наших данных и представлений о структурном своеобразии этого белка, обладающего в отличие от всех других вндотоксинов ВТ, гемолитической активностью.

N-концевая последовательность белка BTI с Мг 70000 и эндотоксинов группы feuratakl имела только четыре совпадающих аминокислотных остатка из 16 сравниваемых. Это позволило сделать вывод о существенном структурном отличии и етого белка BTI от вндотоксинов группы fcurstafct, которые, как известно, отличаются крайне высоким консерватизмом

структуры в N-концевлм участке последовательности.

Нам не удалось найти гомологии между установленной нами последовательностью белка BTI с Mr 700QQ и структурой ендотоксішов BTI с Mr .134400, 127500 и 70000(Thome). Однако, 14 из 16 аминокислотных остатков выделенного нами белка оказались идентичными N-концевой последовательности белка ВІГІ о Mr 72357 (Donovan). Более того, амино-концевая последовательность фрагмента (Mr 40000) изучаемого нами белка оказалась идентичной на протяжении 14 остатков структуре белка BTI Donovan(см стр.35).

Можно било би предположить, что речь идет об одном и том же белке. Тем не менее, мы считаем, что имеем дело с N-концевым доменом белка с Mr 130000, поскольку при его расщеплении BrCN были получены фрагменти, мол. веса которых (40000, 35000 и 5000) не соответствуют теоретически рассчитанным (7000, 85000, 4400, 2200, 1500, 37000, 2Э000, 1000, 6500) для соответствующих фрагментов белка BIT Donovan.

BTI 127500 (Sen)

ВИ 72357 і Donovan)

BTI 70OOO (Thome)

ЇУД 130000 (Schnepf)

MetAspSerGyBTyrProbeuAlaAsnAspLeuCJlnGlySerMetLeu

MetOliUsrpCogroLeuABpThrLeuSerlleValAsnQluThrABp MetGlikBpSerSerteuAspThrLeuSerlleValAsnQluThrAop

MetAsnProTyrGlnABnLysABnQluTyrQluIlePheAenAlaPro Metjluj^snLeuABnPheTrpProJLeujjlnABpIleLyBTyrAsnPro MetishksnlEnproksnlleAsnOluOyelieProTyrABnCysLeu

Рис.11 N-концевые последовательности эндотоксинов BTI.

Таким образом, впервые выделен и охарактеризован один из шсокомолекулярных ендотоксішов, продуцируемых подвидом ВТІ - белок с !г 70000 (предположительно N-концевой домен белка с МгІЗОООО), Показано, [то етот ендотоксин, также как и ендотоксин с Mr 28000, резко отличается го первичной структуре от вндотоксииов других подвидов ВТ, что :оррелирует с существеными различиями в специфичности действия втих іелков (токсичностью в отношении насекомых разных отрядов - leptctoptera ; Dipt era ). В то же время, выявленные структурные отличия между разными ндотоксинами подвида BTI дают основание ожидать более узкой пецифичности в действии втих белков на разных представителей отряда Чрїега (например, Сиіех, Аейез, Anopheles), что характерно для труктурно отличных эндотоксинов других подвидов ВТ в отношении асекомых отряда Leptdoptera.

3(:

6. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТОКСИНОВ ПОДВИДА GALLERiAE (GAL) Производство инсектицидных препаратов на основе культур подвида GAL(препарат внтобактерин) организовано у нас в стране в 1959 г. Промышленное производство препаратов обусловило необходимость получения высокопродуктивных фагоустойчивых штаммов. При этом, нередко генетико-селекционнэя работа приводила к отбору фагоустойчивых и кристаллообра-зующих штаммов, которые, однако, теряли активность по отношению к тест-насекомому втого подвида - гусеницам Galleria mellonella и поэтому рассматривались как нетоксичные. Это требовало тщательного анализа кристаллообразующих белков, продуцируемых разными штаммами втого подвида.

Мы показали ранее, что внтомоцидше кристаллы, продуцируемые подвидом GAL, часто имеют многокомпонентный состав и содержат несколько белков с разной мол.массой -135000, ІЗООООи 65000, но только присутствие одного из втих компонентов (белка с Ur 130000), коррелирует с токсичностью штаммов втого подвида для гусениц Galleria mellonella. Для изучения были выбраны кристаллы, продуцируемые штаммом 11-67, содержащие по данным влектрофореза только один белок с Mr 130000, при активации которого ферментами образуется истинный токсин с Мг около 65000.

В растворе истинного токсина при рокет-иммуноелектрофорезе (рН 8,6) были обнаружены два различающиеся по заряду компонента, один из которых двигался к катоду (положительный компонент, ПК), а другой - к аноду (отрицательный компонент, ОК).

Оба компонента имеют мол.массу около 65000. Для их разделения была применена ионообмегашя хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8,6 в присутствии 2М мочевины. Белок, соответствующий ЯК, не связывался с ионитом а ОК - влюировался при невысокой концентрации NaCl.

Протоксины, соответствующие каждому из втих компонентов были разделены также с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. При этом, протоксин, соответствующий ПК. (ІШК), слабо связывается с ионитом и вотируется 0,3M NaCl (Рис.9). Протоксин, соответствующий ОК (ПОЮ, связывается очень прочно и его удалось выделить только в виде фрагмента с Мг 95000, который образуется после инкубации с трипсішом протоксина, прочно связанного ионитом.

Выделенные белки (ПК и ОК) отличаются между собой и от эндотоксинов группы kuratakl по антигенным свойствам (см.раздел 2) и по спектру биологического действия в отношении насекомых отряда beptctoptera. ГО токсичен для гусениц Gaiter(a mellonella, вызывая 100 ингибирование питания у насекомых в концентрации 2 мкг/г корма, в то время как ОК иш'ибирует привес гусениц на 90 только при концентрации 55 мкг/г.

І90 мл

"280

ІО

Рис.9. Разделение протоксинов(ППК и ПОК), соответствующих ПК и OK,

с помощью ионообменной хроматографии на ДЭЛЭ-целдюлозе (1,6x30см). Колонка уравновешена р-ром 2М мочевины, 1мМ ДТТ,40мМ NaCl, рН 8,6. I - ППК (Mr 130000), II- фрагмент ПОК (Иг 95000).

Напротив, ОК значительно более токсичен для гусениц Lymantria dispar, при этом ЛК(-₀ для ОК равна I мкг/г, а для ПК - 55 мкг/г корма №,-₀ концентрация токсина в корме, вызывающая гибель ЪО% насекомых).

ОК и ПК имеют близкий аминокислотный состав, похожий на состав истинных токсинов из других подвидов(Таол.Э).

С помощью автоматического метода Эдмана Дыла установлена ашшоконцевая последовательность как для ОК, так и для ПК.

Для ОК обнаружено 65 гомологии структуры с последовательностью соответствующих участков впдотоксішоб гругаш kurstaki, что доказывает их несомненное родство. Вместе с тем замена 7 аминокислот на участке протяженностью в 23 аминокислотных остатка, расположенном в районе строго консервативном по последовательности у эндотоксинов группы kurstakt, указывает на существенное расхождение этих структур. Это ставит под сомнение установившееся в последние годы представление о строгой консервативности структуры N-концевой четверти эндотоксинов, ответственной за механизм действия. Вероятно, ето справедливо только в отношешш антигенно близкородственных эндотоксинов группы kurstaki.

Действительно, ендотоксини подвидов THU и MV2', полная первичная структура которых установлена соответственно Brizzard и НотоеЛ в конце 1988 г, антигенно не родственные эндотоксинам группы kurstaki, хотя также поражающие насекомых отряда leplclptera, как и ОК структурно отличаются от эндотоксинов етой группы в М-концевой четверти молекулы. Причем, если ендотоксин подвида EOT на отрезке последовательности из 23 аминокислотных остатков имеет примерно такой же процент замен (39-t), как

з:;

KUR HD-1-D GAL fOK) ENT THV

29 I iKJYTPI D1SI srfjfc FU. 3EPV IETGNTV/ D1S1 .С|іл|. PI Ї SNPV ISpGKSSIDISJS ^VC ПV 3NFV

^^ijVQTGIf^AGHILGVjt 3V^[a

Рис.10. Сравнение N-концевол последовательности одного из истинных токсинов подвида GAL (ОК) со структурой ендотоксинов группы kurstakt, в также ендотоксинов подвидов THU и ENT.

и ОК (35Я)і то для эндотоксина подвида ТИП характерно гораздо больше отличий (74). Эта же закономерность прослеживается при сравнении полных огруктур ендотоксинов подвидов ТИП и ENT с ендотоксинами группы kuratakl Таким образом, среди кристаллообразующих белков ВТ, токсичных для Lepidoptera, впервые обнаружен токсин, существенно отличающийся от ендотоксинов хорошо охарактеризованной группы kurstakt в структурно консервативном у последних N-концевом районе. Вероятно, етот белок (ПОК) вместе с ендотоксинами ENT и THU следует отнести к особой структурной группе ендотоксинов ВТ, сохранившей высокий консерватизм в организации С-концовой половины молекулы (77-95 гомологии при сранении THU и ЭТ о ендотоксинами группы kurstakt), но претерпевших довольно существенные расхождения (40-70) в структуре N-концевой четверти молекулы.

GAL (ПК)

IANJL- ^__^ YPUpT^-N?lilJ3I)I^YK|i}l|WTAl|JN'fEA.

YPljEjj з|| -mi^SrNYKDWb4lj!QQHQQY0 yPIAT^L-EGSM|OTNYKDVn|iiMp^QQYa

Рис. II. Сравнение аминоконцевой последовательности истинного токсина подвида GAL (ПК) с ендотоксинами подвидов ВТІ и ТЕП.

Ачтагоконцевая последовательность второго токсина подвида GAL -ПК - вовсе не гомологична ендотоксинам группы kurstakt, а также ендотоксинам подвидов ТШ и ЕЭТ. В то же время неожиданно обнаружено сходство ПК (60 гомологии) с последовательностью ендотоксинов ВТ1 и ТЕП (Ногte,1987), поражающих личинки других отрядов насекомых - Dlptera и Coleoptera.

Как уже говорилось (раздел 5), ввдотоксшш ВТ1 резко отличаются по

структуре от эндотоксинов других подвидов и с эндотоксинами группы t&irstaki в С-концевой половине молкулы имеют 40% гомологии и только 20% - в N-концевой. Между собой эндотоксины Bfl (Mr 134400 и 127500) в N-концевой половине молекулы также имеют только 20% гомологии (около 120 совпадающих аминокислотных остатков). Поэтому наличие у них протяженного участка из 22 гомологичных аминокислотных остатков свидетельствует о высоком консерватизме его структуры,что, возможно, отражает определенную функциональную нагрузку. Именно на втом отрезке структуры и обнаружена гомология между токсинами ВТІ, TEN и ПК.

Резкое структрное отличие ПК от эндотоксинов группы kurstaki и определенное сходство с эндотоксинами ВІГІ, обнаруженное на коротком отрезке структуры (всего II аминокислотных остатков) в N-конце, получило подтверждение при анализе участков аминокислотных последовательностей, установленных секвенированием структурного гена протоксина, соответствующего ПК(ППК). Работы по клонированию и секвенированию этого гена проводятся в лаборатории под руководством А.Л.Остермана, Как видно из данных, представленных на Рис.І2 , в С-кокцевом районе, высоко консервативном у ендотоксинов группы kwatakl, эндотоксинов подвидов ТШ и ЕЯТ, ГОШ отличается от последних примерно в той же мере, что и эндотоксины Bfl.

KGHVDVEE&lHqRSvEvi|pX CMSCJASVQC DGNTfflf ЬЧіЦ

: гас ЕУ 5іШж Yjn|WT/ І ikfiv 3 Ё

KUR HD-1-D ~

GAL (ППК)

КУЯ HD-1-D GAL (ППК) ВТІ

Ж/Я KD-1-D

ОЛІ(ППК)

KUR HD-1 -D GAL (ППК) ВТІ

1075 vfifcmYTVNQEEYGGAYTSR

GCTTI UEIENlht

Tfii Ааннтй ш щ.

С GYY^;

0JU|J

EEEIYPOT lYDINGTYVi

!E

1125 NRGYHEAPSVPADYASVyEEKSraDGHRENPCEi^,NRGYRCy2^,PI

юкшіігеЗжлШіїї оіітісМ

i(rmnp

|руі{і(ї)фнта4ффя'Ефу[і|4і1зідьісммв

Рис. 12 Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевых участков протоксинов подвидов BIR (RD-1-D), GAL (ППК) и BTI (Mr 134400)

Хотя нам не удалось обнаружить токсичности ПК на одном из представителей отряда Dlptera - личинках Aedes aegypti, не исключено, что втот вндотоксин может поражать других насекомых данного отряда.

Таким образом, впервые установлено, что среди ендотоксинов, поражающих личинки одного и того же отряда {Lepldoptera), есть белки, отличаюоріеся по структуре от эндотоксинов группы kurstakl в такой же мере, как и токсичные для насекомых другого отряда - Dlptera, ендотоксини BTI. Вероятно, это в какой-то мере отражает уникальную специфичность действия втого эндотоксина на гусениц Gallerta mellonella, устойчивых ко всем другим известным в настоящее время ендотоксинам ВТ.

Эндотоксины большинства подвидов ВТ с Mr около 130000 имеют сходную молекулярную организацию и содержат в своей структуре стабильный N-концевой домен, соответствующий истинному токсину.

В условиях ограниченного протеолиза трипсином удалось показать, что расщепление протоксина протекает ступенчато путем последовательного отрыва от карбоксильного конца небольших фрагментов, имеющих у всех ендотоксинов одинаковый размер (Мг около 15000). Эти С-концевые фрагменты после отщепления от молекулы протоксина не так стабильны, как N-до-мен, и быстро и глубоко деградируют.

Разница в мол.массе у исходных протоксинов (в работе были использованы ендотоксини подвидов GAL, ALE, THU с Мг 130000, 1Э5000 и 145000 соответственно) сохраняется у истинных токсинов (65000, 70000 и 60000) и, следовательно, у всех протоксинов расщепляемая С-концевая половина имеет примерно равную мол.массу (около 65000),

Сходство молекулярной организации С-концевой половины молекулы, даже у антигенно неродственных ендотоксинов, подтверждено при анализе первичной структуры етих белков (98J6 гомологии в этой части молекулы обнаружено среди ендотоксинов группы kurstakt; 80-95 - между ендотоксинами подвидов ГШ, ЕКТ и ендотоксинами группы kurstakl и 40% гомологии между последними И ендотоксинами BTI).

Функциональная роль етой части молекулы ендотоксинов до сих пор не ясна. Ранее, учитывая высокое содержание в ней остатков цистеина, предполагали ее участие в поддержании структуры кристалла. Действительно,

остатки цистеина распределены в молекуле эндотоксинов ассиметрично, причем подавляющее большинство (90%) приходится именно на С-кснец. Такой принцип построения сохраняется даже у структурно отдаленных белков. Однако, эндотоксины BTI с Mr 70000 и 28000, москитный фактор (Mr 65000), токсин подвида TEN (Mr 70000) формируют кристаллические включения в клетке, не имея подобной части молекулы. Поэтому, более вероятно, что С-концевая половина молекулы способствует поддержанию белка в растворе, так как более гидрофильна по сравнению с очень склонной к агрегации N-концевой половиной молекулы, что, возможно, отражает ее приспособленность к взаимодействию с мембранами.

N-Концевая половина молекулы у эндотоксинов группы kurstakl (ИНН и ALE) построена из двух субдоменов, соответствующих консервативной и вариабельно? по структуре четвертям молекулы. Если такая организация белка действительно отражает определенную функциональность, то подобный принцип организации должен сохраняться и у других эндотоксинов, в том числе и у иммунологически и, следовательно, структурно отличных.

Нами показано, что белок BTI с Mr 70000 (Ы-домен белка с Mr 130000) при ограниченном протеолизе трипсином расщепляется с образованием фрагментов с Mr около 40000. После 'отделения образующихся при гидролизе низкомолекулярных пептидов сумма фрагментов подвергнута автоматическому оеквенироваїшю. Прочитаны две аминокислотные последовательности, одна из

ВТІ 72357 (Donovan)

Mr 40000 Mr 40000

которых повторяла установленную нами ранее аминоконцевую последовательность втого белка, а другая - совпала с последовательностью белка с Mr 72357 (Donovan), начиная с 362 остатка. Это свидетельствует о наличии в структуре N-концевой половины белка BTI, как и в ендотоксинах группы Izurstakl, двух субдоменов, соответствующих первой и второй четвертям молекулы протоксина. Следует однако отметить, что для ендотоксинав BTI не характерно разделение субдоменов по структуре на консервативный и вариабельный.

Полученные результаты позволили предложить модель структурно-функциональной организации эндотоксинов ВТ (Рис.13).

з:

ЭНДОТОКСИНЫ (прОТОКСИНы), акТИВНЫв На Lepidoptern (Mr 130000).

І 65000-ВОООО Нібт.Ь- ІІбт.Ь-П&тіІЧТбтП

Истинный токсин

Консервативный (//Вариабельный' участок \/// /.участок///

узнавание мишени

токсическое действие

'///?Я&/////

Эндотоксины, активные на Diptera

(подвид ВТІ) \—1 30000"~1—Г 30000 У

Рис. ІЗ Структурно-функциональная организация эндотоксинов ВТ.

8. МНОЖЕСТВЕННОСТЬ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ ВТ.

Одновременная продукция нескольких эндотоксинов, отличающихся пс мол.массе (135000, 130000 и 65000) и антигенным свойствам, была показаш нами еще в 1980г при анализе белкового состава кристаллов разных штаммої подвида GAL (см.разделы 1 и 2). Обнаружение и разделение двух эндотоксинов с одинаковой мол.массой (130000), формирующих кристаллы штамма П-67 втого подвида, и доказательство их существенного структурного различия (раздел 5), определяющего резкие отличия в специфичности их внтомоцид-ного эффекта, явилось прямым доказательством одновременной экспрессии одним штаммом двух разных структурных генов эндотоксинов.

Таблица 7.

Одновременная продукция эндотоксинов рядом штаммов ВТ.

Действительно, в последнее время у ряда подвидов ВТ (KUR, AIZ, MOR, ENT) из одного штамма клонированы от двух до пяти структурных генов дельта-ендогоксинов (Visser,1988). Однако, одновременная вкспрессия нескольких генов, приводящая к продукции штаммом нескольких ентомоцидньїх белков, до последнего времени Сила показана только для штаммов подвида ВТІ (эндотоксины с Mr 130000, 70С00 и 28000), поражающего личинок отряда Dlptera. Нами впервые обнаружена одновременная продукция двух отличающихся по специфичности действия вндотоксинов, патогенных для личинок отряда Lepldoptera.

Множественность вндотоксинов, продуцируемых одним штаммом, расширяет круг чувствительных к его действию насекомых, что обеспечивает ему определенное аналогическое преимущество.

е. проїЕолитачЕааш шшгвд вї,

Роль ендогенних протеинаэ в гидролизе эндотоксинов в момент растворения кристаллов и в процессе работы с этими растворами подробно обсуждалась ранее. Не исключено, что протеиназы могут вызывать гидролиз не только растворов вндотоксинов, но действовать и на кристаллы при длительном хранении споро-кристаллических смесей. Возмоняшй протеолиз кристаллов может быть причиной падения инсектицидной активности промышленных препаратов при хранении.

Разработка эффективных способов защиты белка от протеолиза требовала подробной характеристики участвующих в этом процессе ферментов. К началу нашей работы были обнаружены и частично охарактеризованы внеклеточная ыеталлопротеиназа подвида КУЙ (Ы,1975) и внутриклеточная сериновая протеиназа (Leoadet,1980).

Спектр внутри- и внеклеточных прошенная ВТ и дьаалииа их образования.

Динамика появлеїшя протеинаэ в клетках и в культуральной кидкости изучена нами в процессе роста трех (шт.696,11-67,6а) кристаллообразующих и одного (49с) акристаллнческого штамма подвида GAL, а также у одного (шт.20) аспорогешгаго, не образующего кристаллы мутанта.

Активность протеинаэ в экстрактах из бактериальных клеток и в культуральной жидаости определена на разных стадиях роста и сдаруляции культур с помощью специфических хромогенних субстратов. Сериновые протеиназы, активные по субстрату ZAiXpNA, обнаружены в клеточных екстрактах всех изученных штаммов. Эти ферменты различаются по електрофоретической подвижности. Так у всех исследованных штаммов била

обнаружена протеиназа с R_f 0,9. Вероятно, втот фермент, аналогичен внутриклеточной сериновой протеиназе, описашюй у ВТ Lecadet, и лохо» на внутриклеточную сериновую Протеїшазу Bac.subtilia. В екстрактам некоторых штаммов (20, 6а) обнаружена протеиназа, остающаяся пр: електрофорезе в верхнем геле, а также протеиназа с R, 0,1-0,2.

У всех штаммов ВТ в клеточных екстрактах выявлена протеолитическа* активность по п-китроанилиду -карбокси-прогагонил-феїшлаланина - субстрату, специфичному для химотрипсиноподобнах протеиназ. R» протеиназы равен 0,1, рН оптимум - 7,0.

Активность по п-нитрознилиду N- бензоил-Ші-аргинина, субстрату трипсиноподобдах ферментов, обнаружена у штамма 49с.

Таким образом, в клетках разных штаммов ВТ обнаружено не менее ^тырех сериновых протеиназ.

Обнаружить в экстрактах клеток металлопротеиназу по субстрату DNP-Gly-Gly-Ile-Arg не удалось.

На Рис.14 представлены сводные графики по динамике образовать сериновых протеиназ в клетках и культуральной жидкости изученные штаммов. Видно, что сериновые протеиназы внутри клеток появляются на раї них втапах споруляции и достигают макимального уровня к t~-t., в то время как внеклеточные появляются позднее и уровень их активности постоянно возрастает вплоть до момента образования терморезистетных спор (*₁₂)

. . w > -і о і а >г ,..

Рис.14 Динамика появления сериновых протеиназ в клетках (I) и

культуральной жидкости (II) в процессе роста и спорообразования ВТ.

1 - шт.696, 2- шт.П-67, Э - шт.ба, 4 - шт.49с, Ъ - шт.20.

t₀- время споруляции. Протеазная активность измерена по ZAAbpNA.

У акристаллическия штаммов (49с и 20) активность внутрихлеточны протеиназ серинового типа снижена по сравнению с кристаллоооразующим штаммами в Э-4 раза, И , скорее всего, не они являются причино

отсутствия кристаллов в этих штаммах.

Помимо сериновмх протеиназ некоторые штаммы ВТ секретируют металлопротеиназу и/или карбоксипептндазу типа В или С, что следует из обнаружеїшя активности в культуралыюй жидкости по субстратам DNP-Gly-Gly-Ile-Arg и ШР-Ala-Ala-Lys.

Начало синтеза металлопротеиназы предшествует секреции сериновой протеиназы (Рис.15).

yAf-Jjto^HX/wa

Рис.15. Динамика накопления внеклеточных протеиназ в процессе роста культуры ВТ.

I - А_б40 культур ВТІ и FIN; 2-3 - активность сериновых протеиназ BTI и FIN соответственно; 4 - активность металлопротеиназы

в культуре 8TI.

-t а і л а іь

зависит от штамма и может

протеиназы БТ

Уровень продукции внеклеточных ферментов различаться на два порядка.

Нами подробно охарактеризованы внеклеточные вериновая и металлопротеиназа.

Четаллопротеияаза ВТ.

Для выделения протеиназ ВТ был использован метод аффинной іроматографии на сорбентах (сефарозе и силохроме), содержадих ковалентно трисоединенный циклический антибиотик бацитрацин. Протеиназы связываются з бацитрацином, содержащим ряд гидрофобных аминокислот. В то же время, із-за содержания нескольких D-амююкислот и, возможно, особенностей іщклопептидной структуры, Сацитрации устойчив к протеолизу. Металлопротеиназа не столь прочно связывается с сорбентом, как зериновая ігротеиназа, и для ее элюции требуется только воздействие зысокой иошюй силы - добавление Ш Ыа01. Для десорбции серішової тротеиназы необходимо присутствие изопропанола (25).

Металлопротеиназа была выделена из культуральной жидкости тт.2395 подвида BTI (Табл. 8).

Выделенный фермент гомогенен при диск-електрофорезе в присутствии 3DS. Молекулярная масса фермента около 35000, оптимум рН фермента 7,0, температурный оптимум - около 60. Фермент стабилен при рН 8,0-6,0, При

Таблица 8. Очистка внеклеточной металлопротеиназы ВТ ( из подвида ВТ1).

Стадии очистки

Белок Суммарная Удельная Степень Выход AggQ активность активность очистки %

"280

температуре 70 в присутствии ионов кальция фермент сохраняет 505 активности в течение 30 мин.

Вас.ату. Bac.aubt. Вас.therm. ВТ Ваа.сег.

Vaj ЗегІїеиАБп ValProLeuAen

AlaAlaThtlhrQIyThrpiyThrThrLeuLyf JlyLyepu AlaAlaAls ThrtljIserGlyThrThrLeuLys GlyfuaTHr

Il4ThrClyThrperVaIGli^aj01y{Ar^GIyValIeu01yAsp

ValThrGlyThrAEnbyeValGlyTlirGlyLysUlyValLeuGlyAsp ValThrGlyThur'ABnLysValGlyTlirGlyl^EGlyValXeuOlyAsp

Рис.16 Сравнение аминоконцевой последовательности металлопротеиназы ВТ і ферментами B.amylollquefaclena,B.aubtllt8,B.thermoproteolltlcua,B.cereu.

Амижжонцевая последовательность металлопротеиназы ВТ (Рис.16) идентична известной последовательности металлопротеиназы Вас.сегеиз Вместе о тем, металлопротеиназа ВТ на этом отрезке структуры имеет 75! гомологии с термолизином и только 40-45 гомологии - с протеиназам Вас.amylollquefoclena и Вас.subtil Is

Внєїиєточние сериновые тиолэависшсые протеиназы ВТ и BAC.CERWS. Практически все микроорганизмы продуцируют протеолитически ферменты, относящиеся к классу сериновых протеиназ. Среди ферменто

этого класса выявлено несколько семейств еволюционно родственных протеинаэ, которым свойственна не только одинаковость построения каталитического центра, но и однотипность пространственной структуры, обеспеченная более или менее выраженной гомологией первичных структур. Наиболее изучены семейства химотрипсина (к нему относятся все сериновце протеиназы животных, а также сериновые протеиназы некоторых стрептомицетов) и субтилизина, которое включает в себя протеиназы бактерий и некоторые протеиназы стрептомицетов и грибов. В составе семейства субтилизинов в настоящее время выделяют несколько подсемейств - собственно секреторные субтилизины, подсемейство внутриклеточных сериновых протеинаэ, а также подсемейство SH-содержащих сериновых протеинаэ, к которому до последнего времени относили только ферменты, обнаруженные у термофильного актиномицета Thermactіпітусез vulgaris и стрептомицета Streptomyces rectus.

Несмотря на достаточно подробную изученность протеинаэ, секретируемых бациллами, до недавнего времени среди них не находили тиолзависимых сериновых протеинаэ. ВТ оказался первым видом, для которого показан синтез подобного фермента. Установление близкого структурного сходства протеиназы ВТ с тиолзавиоимой сериновой протеиназой из таксономически отдаленного микроорганизма термоактиномицета, делало интересным поиск ферментов данного типа и у других видов бацилл, и, прежде всего у видов, родственных ВТ. Такого типа фермент был обнаружен у Вас.сегеиз, микроорганизма, очень близкого ВТ.

Аминокислотный состав внеклеточных сериновых протеинаэ ВТ и Bac.cereus, выделенных методом аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих ковалентно связанный фенилборонат или циклопептид бацитрацин, сопоставим с субтилизинами. Однако, исследуемые протеиназы отличаются от секреторных субтилизинов повышенным содержанием глутаминовой кислоты и, главное, присутствием цистеинв. В еще большей мере выделенные ферменты близки по аминокислотному составу тиолзавиоимой сериновой протеиназе из Tha.vulgaris, характерным признаком которой является квк раз наличие цистеинв в аминокислотном составе.

Ферменты ВТ и Bac.cereus безусловно принадлежат к классу сериновых протеинаэ, так как полііостью икактивируются под действием специфических ингибиторов протеинаэ этого класса - ФМСФ и ДФ$. Однако, в отличие от субтилизинов, но подобно тиолзавиоимой сериновой протеиназе термоактиномицетов, их активность подавляется и реагентами на сульфгидрильную группу - парахлормеркурбензоатом я ацетатом

ртути.Очевидно, что обнаруженный в составе этих протеиназ остаток цистеина, существенен для активности ферментов, поскольку расположен, по аналогии с тиолэашсимой сериновой протеинаэой из термоактиномицета, в непосредственной близости от функциональных групп активного центра, в частности остатка аспарагиновой кислоты-32. SH-группа в тиолзависимых еериновых протеинаэах обладает необычными свойствами и не реагирует с

Таблица 9 Основные физико-химические характеристики внеклеточных. еериновых протеиназ ВТ (подвид GAL), Bac.cereua, Tha.vulgaria и субтилизина BPN'.

Характеристики

Субтили- Т.vulgaris ВТ Вас.
зин BPN" GAL сегеиз

Молекулярная масса

Оптимум рН активности по

ZAALpNA

Температурный оптимум

активности по ZAALpNA

рН стабильность

Удельная активность по ZAALpNA

(мкмоль мин на I мг белка)

Остаточная активность {%) после

обработки:

Д4Ф <10~³М)

«МСФ (10~³М)

Hg(0H₃COOH)₂ <10~³М>

р-хлормеркурбензоатом (10~³М)

ЭДТА(Ш~³М)

влкилирукхцими реагентами, такими как иодацетамид и N-птиленмалвимид, не окисляется, хотя присоединение иона ртути или ртутьорганическш соединений полностью блокирует фермент.

По функциональным свойствам (Табл.9) внеклеточные сериновые протеиназы ВТ и Вас.сегеиз проявляют много общих черт как < Ьубтидизинами, так и с ферментом из Tha.vulgprle.

Сериновые тиолзависимые протеиназн ВТ и Вас-, сегеиз расщепляю'

хромогенные пептидные субстраты субтилизшіа — n-нитроанилиды ряда защищенных трипептидов, белковые субстраты, а также сложноэфирнме субстраты. Помимо большого сходства внзимологических свойств, аминокислотного состава, содержатся функциональна важной меркаптогруппы нротеиназы ВТ и BQC.cereus необычайно близки ферменту из Т)ш. vulgar із и по N-концевой последовательности - для них отмечено совпадение 12 аминокислотных остатков из 14 сравниваемых.

На)

Вас.amy.

Tha.v.

В.car.

ВТ(GAL.FIN)

m(BTI)

фрырруфвфус}^ nob а

WCTNDPV^CW-QyGLCJ CLxjlP t}

WTPNDPmii-QYGLj

ftTPMPPY?$J-QYGI

Рис.17 N-концевые последовательности тиолзавнсимых сериновых протеиназ ВТ (подвида GAL, BTI. FIN), Вас.сегеиз, Tha.vulgorta и субтилизина BPN'.

Степень гомологии первичных структур всех трех рассматриваемых сериновых протеиназ с амшюконцевой последовательностью субтилизина BPN' не высок - только четыре совпадающих остатка из 14 сравниваемых. Поатому сопоставление только N-концевых последовательностей тиолзавнсимых протеиназ бацилл и субтилизинав давало лишь скудные указания на наличие отдаленного сходства между первичными стуктурами этих ферментов. В результате само отнесение тиолзавнсимых сериновых протеиназ этих видов бацилл к семейству субтилизина было основано на их функциональном сходстве и соответствии ряда обадіх характеристик - молекулярной массы, аминокислотного состава, некоторых внзимологических свойств, но не могло опираться на прямые структурные дашше.

Впервые такие данные были получены при сопоставлении первичных структур участков ферментов, непосредственно примыкающих к остатку серина-221 активного центра. Для втого было проведено расщепление тиолзавнсимых сериновых протеиназ ВТ и Вас.сегеиз по единственному имеющемуся в их структуре остатку метиошша. Образующиеся при этом С-концевые фрагменты обоих ферментов, содержащие около 60 аминокислотных остатков, были отделены от остальной части молекулы ультрафильтрацией через мембрану UM-I0 и их ашшоконцевая последовательность определена твердофазным методом Эдмала.

YUA/lAJ

[J'WQA.UQ

В.amy. B.llch. Tha.v. ВТ

утек

YYGRp

ПйрнуаЗлШ iiskhpnwtniQvjSjslqn йиа-ссБї

Xg РНУА(^АЦІІВКІЇРШ@АБРЩ fflLSS l{ATYL-GSS.t

ATPHVAGYAgUjJs 3 — ^ E JsHtA Ї SN iJaJDKISOTGTYT?AK iRVNAYKAV ATPHVAQVAALL/JN 2 — ^ S Ніріфі ISS fTDKlSGTGTYV.|cM JRVNAXKAV

AK

Рис.18 Последовательность С-концевых участков внеклеточных
сериновых протеиназ ВТ (подвидов GAL, В'П, PIN), Tha. vulgaris

(Tha.v.) и субтилизинов - BPN' (В.ему.) и Карлсберг (B.llch.).

Результаты определения N-концевых аминокислотных последовательностей С-концевых фрагменов протеиназ ВТ и Вас.сегеиз впервые дали прямое доказательство структурного соответствия тиолзависимых сериновых протеиназ бацилл и субтилизинов. На участке 222—243 из 22 сравниваемых аминокислотных остатков у субтилизина и протеиназ ВТ и Вас.сегеиз совпадают II (50). Это - бесспорное свидетельство гомлогии первичных структур, видамо, распространяющееся и на просгранствешше структуры. Сходство гораздо выше при сопоставлении непосредственно примыкающего к серину-221 участка 222-233 - на нем из II сравниваемых совпадает 9 аминокислотных остатков или 82. Очевидно, втот участок менее вариабелен из-за его функциональной" нагруженности".

Выявлено очень большое сходство участков 222-243 тиолзависимых протеиназ двух видов бацилл с тиолзависимой протеиназой из термоактиномицетов - единственное отличие состоит в замене остатка алакина-232 у протеиназ бацилл на глицин в протеиназе термоактиномицетов. В аминоконцевых участках етих ферментов процент совпадений несколько меньше - 64 при сравнении протеиназа !7td. vulgaris и Вас.сегеиз и 71 - для пары протеиназ Tha.vulgaris и ВТ.

Таким образом, тиолзависимые сериновые протеиназы Вас.сегеиз и ВТ чрезвычайно близки между собой, что отражает близость втих двух видов бацилл. В то же время обе они весьма близки и протеиназе из термоактиномицетов, что позволяет объединить их в особое подсемейство субтилизинов - тиолзависимых сериновых протеиназ. Консерватизм первичных структур тиолзависимых сериновых протеиназ микроорганизмов, до последнего временя' считавшихся принадлежащими к весьма разным таксонам, требует внимательного анализа и может указывать на вволюционные связи между термоактиномицетами и упоминавшимися выше двумя видами бацилл. Наконец, получены несомненные свидетельства структурного родства тиолзависимых сериновых протеиназ и субтилизина, надетою обосновывающие

принадлежность подсемейства тиолзависимых сериновых протеиназ к семейству еволюционно родственных субтилизшюв.

В заключение следует отметить, что роль сульфгидрильной группы в тиолзависимых сериновык протеиназах пока не ясна, но неизменное появление остатков цистеинв, обладающих сходной реакционной способностью в нескольких ферментах, образуемых представителями различных таксонов микроорганизмов - термоактиномицетами, бациллами, дрожжами и грибами, указывает на их возможное участие в функционировании протеиназ.

Значителыше различия в первичной структуре эндотоксинов ВТ, обычно не свойственные белкам, синтезируемым микроорганизмами одного вида, указывают на необычно высокий темп эволюции втих белков. В связи с втим возникал вопрос, произошло ли закрепление различий и в ряде других биохимических и физиологических характеристик в процессе дифференцирования подвидов ВТ или же изменения подобного масштаба затронули только эндотоксшш. Для выяснения атого вопроса мы сравнили между собой сериновые протеинази, секретируемые клетками разных-подвидов ВТ. Для этого били выбраны подвиды ВТ - GAL, ВТІ и РШ, существенно различающиеся биохимией и морфологией вегетативных клеток и, главное, свойствами эндотоксинов.

Сериновые протеиназы, продуцируемые етими подвидами, были получены з чистом виде и охарактеризована. Выделенные ферменты близки между зобой по химическим свойствам, мол.массе, оптимуму протеолитической зктивности , аминокислотному составу и аминоконцевой последовательности їблизи остатка серина активного центрі) (Рис.18).

Полное структурное совпадение на участке 282-243 у протеиназ из )азличных подвидов ВТ вполне закономерно в связи с выявленным ранее у иолзависимых сериновых протеиназ высоким консерватизмом структуры на ітом участке, непосредственно примыкающим к Сер-225.

Вместе с тем, сериновые протеиназы трех подвидов ВТ характеризуются ведущими особенностями (Табл.10).

Так, удельная активность протеиназы из подвида ВИ, определенная по убстрату ZAAXpNA, совпадает с удельной активностью протеиназы подвида AL и на порядок превышает удельную активность протеиназы подвида FIN фермента из термоактиномицатов.. Температурный оптимум действия ротеиназы из подвида Оіїнаходится при 45, что близко к температурному птимуму протеинази подвода ВИ (40), тогда как протеинаэа подвида РШ

Таблица 10. Особенности функциональных свойств протеиназ из различных подвидов ЬТ.

Показатели

Подвид
BTI FIN

GAL

Удельная активность по ZAALpHA (мкмоль мин мг белка) Температурный оптимум активности по ZAAipNA

Остаточная активность по ZAALpWA после I ч инкубации при 60{%) Электрофоретичеекая подвижность при рН 6,5:

Количество полос R, основной R_f минорной

проявляет максимум протеолитической активности при 35 , а ферме* термоактиномицетов - при 55.

Различается тиолзависимые сериновые протеиназы и по степеї инактивации при 60, при етом относительно более термостабилы протеиназа подвида BTI.

Обнаружены некоторые различия в N-концевых последовательное^ изученных ферментов (Рис.17).На участке из 2 аминокислот удалось обнаружить струхтрное отличие у протеиназы подвида ВТ1 (лизин-9) по сравнению с ферментами двух других подвидов (аспарагин-9). Весьма вероятно, что различия в структурах ферментов затрагивают и другие участки последовательности полипепгидной цепи.

Выявленные отличия в свойствах сериновых протеиназ разных подвид ВТ, отражающие определенные, весьма небольшие, различия в первичн структурах ферментов, являются результатом вволюции микроорганизм приведшей к диссоциации вида на подвида. Такие различия закрепились ряде других характеристик микроорганизма - антигенных свойсте жгутиков, електрофоретической подвижности остераз и т.п.

Вместе с тем следует заключить, что вволюция фермента шла далеко

столь быстро, как у эндотоксинов. Аномально высокий темп еволхя.

последних, приведший к удивительно большой вариабельности их первича

структуры и к функциональным различиям, обусловлен плазмидг

4? локализацией структурных генов видотоксшюв, существованием механизма трансцепщш у ВТ, наличием в одном геноме нескольких генов близкородственных эндотоксинов, что обеспечивает возможность межгешшх рекомбинаций.