Введение к работе
Актуальность темы.
В связи с ген. что огромное количество растительной биомассы накапливается в виде полимерных Сахаров с большим нолекуляркым весок. Ферменты деполинеризгапие полисахариды представляли и представляют значительный интерес для биотехнологии.
Лихеназы или 1. З-t, 4-бета-0-гижан-*-гяюкан-гилролазы (X. ф. 3.2. і.тз) это пирокии класс глюкангидролаз специфически расшеплякаих I,4-бета-О-гдюкозидные ссязн о бета-глюкалах со снешаиныня I. зм.ч-бста-о-связяни. Природными сгбстратамн для этих Ферментов являются бета-глгканы клеточных стенок эндосперма злаков (до 1С* от сухого веса зерца) или лихеная пол/чаемый из водорослей. Cetraria lslandlca.
Наиболее интенсивно лихеназы используются в пивной проньиленности в качестве добавки к Ферментам солода. Проблемы возникдящке при пивоварении, а именно: уменьшение выхода, снижение скорости разделения сусла и Фильтрации пива, а такхе образование зелатинопсдобкых осадков при хранении пива. в основном свяэяны с неполной деградацией бета-глюканов овса. Образующиеся в процессе прорастаняя зерен ячненя бета-глюканазы разрушают глскаїм клеточки:: стенок зндосперны и тен самым позволяют зльФз-амилазам осахаривать крахнал. Однако часть солодовых бета-глекалаз, з связи с их недостаточной терностабильностью. необратимо инактивируется в процессе сушки зерен, а оставшиеяся Ферменты быстро разрушаются при заваривании солода. Поэтому во время приготовления солода часто добавляют препараты тегнестабильных 1,3-5, ч-бота-глюканаз грибного или бактериального происхохдемгия. Слабин местом подобных препаратов является их недостаточная стабильность при температурах применяемых п пиво карский (до 70С). Ко ипогих лабораториях ведется активный поиск термостабилышх лихенаэ для протащенного использования.
Известно, что одна из наиболее когошо изученных анаэробных термоФллькнх бактерий, С. thcrmocol ішп, помимо пеллюлдз к ксилзназ продуцирует Ферменты обладающие лакивариназиок и ликеиазнрй активностями. Этот микрооргаїшзк. такяе как и другие термофильные бактерии-иеляюлолктики обладает рядон недостатков, которые препятствуют кх непосредственному использованию в качестве источника различии* Ферментов. Поэтому клонирование и экспрессия соответствующих генов в мезоФильных бактериях, в настоявши момент, самый распространенный способ получения и изучения теркостабилышх Ферментов. Клонирован и секвенирован ряд генов С. thermoceliuia. кодирующих эндо-1,4-гдюкацазы и ксиланазный ген. Почти все эти ферменты входят в состав нультиФерментного комплекса, названного педлюлосомой.
Цель и задачи работы.
Цель данной работа заключалась в изучении структуры гена термостабильной лихеназы С. thermoceiium и определении основных свойств продукта данного гена.
В ходе работы решались следующие задачи:
-
клонирование гена лихеназы С. thermoceiium в клетках Е. сои;
-
определение нуклеотидной последовательности гена.
-
создание продуцента терностабильной лихеназы на основе мезофидьных микроорганизмов;
-
изучение свойств Фернента:
Научная новизна и практическая значимость работы.
Нз клонотеки С. thermocellum Ф7 отобран клон продудируюши! теркостабильную бета-глхжаназу и локализован фрагмент ДНК С. thermocellum определяющий синтез данного Фермента. Получеги реконбкнатные плазмиды. обеспечивавшие эффективную экспрессы гена высоко-терностабяльнои лихеназы Clostridium thermocej lum і клетка2 Е. coll и В. subtills ( продуктивность 30ОО0 и ЮООСІ ед/л среды, соответственно). Терностабкльная бета-гяхжаназа и: рекомбіаіантноі-о штамма Е. "сої і TGt (PCU402) очкшена д
омогенности и определены ее основные бкохкннчеасие воиства. На основании данных вискоэннетрического теста, анализа убстратной специфичности и основных продуктов гидролиза лихена-:а и лаиияарнна бета-глюканаза С. thermocellura охарактеризована, :ак лнхеназа (ЕС 3.2.1.73). На настояний нонепт данный Фермент ревосходит все известные препараты, иринєнкюпгиеся в пивоімреп-ой промышленности но термостабильности и удельной активности.
Определена нуклеоткдная последовательность гена лихенази С. heraocellmn. Ка осповг- анализа нухлеотидной последовательности епа определена структура лихенази С. therrooceinnn.
Впервые поісазана иеллюлосонна'я локализация лихеназы.
аличие бета-1, 3-1,4-глюїсанолнтическои Ферментативной активности
неллюлосоме С. thermocellum означает, что эта органелла
чествует не только в гидролизе целлюлозы, но а п деградации
ругнх полисахаридов.
Структура работы.