Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее зремя все большее при-менеште находят биологические средства защиты растений на основе 6-эндотоксинов Bacillus thurlngleiwla, активные в отношешш личинок более чем 300 видов насекомых отрядов Leplcloplerci, Dipt era и Coleoptera. Исключительно высокий уровень избирательности действия <5-андотоксинов требует испол. зования большого их разнообразия для эффективного поражения всего спектра насекомых-вредителей, в связи с этим значительные усилия многих исследователь ^ких групп были направлены на поиск новых <5-ендотоксинов, обладающих ране неизвестным типом специфичности. Таким образом, в настоящее время клонированы и секьлп.рова-ны гены более чем 60 различных дельта-эндотоксинов. Тем не менее, поиск новых дельта-вндотоксшюв и их генов остается актуальной задачей. Кроме того, несмотря на клонирование значительного числа генов <5-еидотоксинов, механизмы их экспрессии, взаиморегуляции и происхождения изучены недостаточно. Вместе с тем, данная модель является перспективной с точки зрения регуляции вкспрессии генов у грам-положителышх микроорганизмов в ходе споруляции и эволюции их генома. Изучение тонких механизмов экспрессии генов б-ондотоксинов может также слугсить базой при создании новых высокоэффективных штаммов-продуцентов 5-эндотоксинов для сельского хозяйства.
Целью данной работы являлось клонирование и структурная характеристика генов 5-окдотоксинов aclllus tbxxrlnglenaia подвида gallertae, втом числе - <5-вндотоксина Сгу.ІР. ответственного за троявление уникальчой специфичности кристаллов ьтого подвида'по отн-шенюэ к личинкам (кЛІетіо, welonella, и криптического reira crylX, локализованного в геноме штамма-хозяина вблизи crylC. На основании данных секвестрования геномного локуса расположения crylG предполагалось изучить молекулярный механизм вкспрессии данного гена и причины нэфункцясналь-ности нового гена crylX.
Научная новизна и практическая ценность работы.
3 данной работе впервые клонированы" и охарактеризованы
гени двух <5-вндотоксинов подвида gallerlae, в том числе: I. ген <5-эндотоксина crylG, значительно отличающегося от известных ранее по первичной структуре и специфичности энтомс одного действия; 2. критический ген crylX локализованный вблизи crylG. В ходе секвенирования геномного локуса, содержащего клошірованіше гени, определена последовательность 12 тысяч пар нуклеотидов. Проведен детальный компьютерный анализ полученной нуклеотидаой последовательности, направленный на выявление потенциальных ре^ляториых элементов клонированных генов, установлена причина криптичности гена crylX. На основании данных сравнения выведенных из нуклеотидной аминокислотшіх последовательностей с известными в литературе <5-ендотоксинами были предсказаны свойства белкоЕых молекул CrylG и CrylX. С применением те-шжи молекулярного клонирования проведена гетерологичная вкспрессия клсиировашшх генов в клетках E.aoll, изучены физико-химические, иммунологические и токсические свойства гетеро--логичных белков. На основании сравнения нуклеотидшх последовательностей crylG и сгуТХ впервые прямо показно участие процессов геномных престроек, не связанных непосредственно с общей рекомбинацией, в эволюции генов й-индотоксинон. В результате анализа фланкирующих областей генов crylX и crylG впервые высказано пред положение об образовании иолицистронных мРНК, кодирующих одновременно два б-эндотоксина.
Клонированные в работе гены использовались для изучения структурно-функциональной организации б-ондотокоинов методами белковой гашонерии. Они могут также применяться для создания трансгешшх растений, устойчивых к вредителям, и разработки новых иносктицидных препаратов на базе 6-андотоксинов CrylX и Cry10. Данные о механизме регуляции экспрессии crylG имеют теоретический интерне и могут применяться для оптимизации окспрессии в Bacillus ttiurlngtenaia.
Публикации и апробация работы. Материалы исследования потеме диооертащпГЪпубликоЕаны в 3 статьях и представлены на Международном Биохимическом Конгрессе в Иерусалиме в 1991г.
Объем и структура работы. Диссертация состоит и: ішодения, обзора литературйТ 1юс"вед5нйГ о структурно-функциональной организации 6-шідрі ксиноь и их генов в геноме Duel Низ