Введение к работе
Уже стало общепринятым мнение, что в клетке новосинтозирующисся белки сворачиваются в нужные конформации и собираются в соответствующие четвертичные структуры не самопроизвольно; а с участием белков-помощников, названных молекулярными шаперонами. Но на данный момент точная роль конкретных шаперонов в реакциях сворачивания и сборки конкретных белков во многом остается неясной. Часто не ясна также последовательность действия нескольких шаперонов на пути сворачивания и сборки конкретного белка.
Белок DnaK является представителем шаперонов
Нзр70-семейства в клетке Е.соЫ, DnaJ работает вместе с DnaK, являясь его кошапероном, и взаимодействует с ним.
Про шапероны Нзр'/'О-семейства давно высказывалась привлекательная гипотеза, что некоторые его представители могут взаимодействовать с растущими полипептидными цепями еще на рибосомах и таким образом способствовать правильному сворачиванию полипептидной цепи еще во время ее синтеза на рибосоме. И действительноj ассоциация с растущими полипептидными цепями на рибосомах была продемонстрирована для трех конкретных представителей Нзр70-семейства: белка Hsp73 из клеток млекопитающих и белков SSB1, SSB2 из дрожжей.
Но до недавне['о времени прямые данные о взаимодействии шаперонов с растущими полипептидными цепями в бактериальных клетках отсутствовали.
Цель и задачи работы.
Целью данной работы являлось изучение влияния шаперонов DnaK и DnaJ на сворачивание и сборку белков в клетках Е.coli.
В работе ставились следующие задачи: 1) изучить взаимодействие шаперонов Е.соЫ с транслирующими рибосомами; 2) изучить агрегацию цитоплазматических белков в мутанте Е.соЫ, лишенном генов dnaK и dnaJ; 3) получить систему синтеза белка in vitro, лишенную шаперонов DnaK и DnaJ, и
_ 4 -
изучить влияние шаперонов DnaK и DnaJ на сворачивание и сборку
модельного тримерного белка хлорамфениколацетилтрансферазы в
этой системе; 4) изучить влияние шаперонов DnaK и DnaJ на
реконструкцию денатурированной гуанидинхлоридом
хлорамфениколацетилтрансферазы.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые продемонстрирована ассоциация бактериальных шаперонов DnaK и DnaJ с растущими полипептидными цепями на рибосомах Е.coll. Показано, что в противоположность DnaK и DnaJ, шаперон НэрбО-семейства GroEL с растущими полипептидными цепями не взаимодействует, но кратковременно связывает полноразмерные новосштезированные белки после их диссоциации от рибосом.
Впервые показано, что в штамме Е.соЫ, лишенном генов dnaK и dnaJ, происходит агрегация многих в норме растворимых цитоплазматических белков.
Получена система сопряженной транскрипции-трансляции in vitro, лишенная шаперонов DnaK и DnaJ; и изучено влияние различных факторов на работу этой системы.
Показано, что действие шаперонов DnaK и DnaJ способствует правильному сворачиванию и сборке модельного тримерного белка: хлорамфениколацетилтрансферазы во всех трех исследованных системах: in vivo, в системе синтеза in vitro и в системе реконструкции денатурированного гуанидинхлоридом энзима.
Структура и объем работы.