Введение к работе
Актуальность проблемы. Многие белки, синтезируемые в цитоплазме ктерий, секретируются за пределы плазматической мембраны. Несмотря на ачительные успехи в понимании молекулярных основ белкового топогенеза, ханизм переноса гидрофильных молекул секретируемых белков через црофобный липидный бислой мембран остается еще во многом неясным, льшинство секретируемых белков синтезируется в виде предшественников, держащих на N-конце сигнальный пептид, необходимый для транслокации яка через мембрану. При отсутствии строгой гомологии в аминокислотных следовательностях сигнальные пептиды имеют ряд общих черт и содержат ложительно заряженный N-концевой домен, центральную гидрофобную сть и более полярную С-концевую область. В то время как решающая роль црофобной части сигнального пептида в транслокации белка через мембрану статочно хорошо изучена, о роли N-концевого домена известно значительно ньше. Наличие положительно заряженных остатков в указанном домене гнального пептида является важным для транслокации липопрстеина (Inouye al., 1982), OmpA (Tanji et al., 1991) и OmpF-Lpp (Sasaki et al., 1990).), но существенным для белка PhoE (Bosch et al., 1989). Таким образом, вопрос о обходимости положительного заряда этого домена остается до сих пор крытым.
С-концевая область сигнального пептида особенно интересна из-за ее влечения в специфическое взаимодействие с сигнальной пептидазой, уществляющей процессинг. С помощью статистического анализа [инокислотных последовательностей сигнальных пептидов про- и эукариотов шо установлено, что в -3 и -1 положениях встречаются только небольшие игральные аминокислотные остатки (правило "-3, -1"). Изучение мутантных кретируемых белков с единичными аминокислотными заменами идетельствовало о важности этих положений в созревании белка. Подробное учение влияния аминокислотных замен в С-концевом домене сигнального птида на процессинг проведено только у двух белков: мальтозосвязывающего лка (МВР) и белка оболочки фага М13 (Fikes et al., 1990; Shen et al., 1991; ircocy-Gallagher et al., 1994). Несмотря на то, что в целом работа по МВР ідтверждала правило "-3, -1", детальный анализ процессинга был щественно затруднен наличием альтернативного сайта отщепления гнального пептида. Кроме того, результаты по изучению мутаций в белке іолочки фага М13 указывали на то, что детерминантами специфичности
лидерной пептидазы могут быть не только аминокислотные остатки положен» -1, -3, но и Pro, находящийся на границе гидрофобного и С-концевог доменов. До сих пор остаются дискуссионными вопросы о размере областе вовлеченной во взаимодействие с лидерной пептидазой, о том, насколько важн природа аминокислотных остатков в положениях -1, -3 и вне этих позиций дл процессинга.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияние аминокислотных замен в N- и С- концевых доменах сигнального пептид; щелочной фосфатазы Е. coll на секрецию и процессинг этого белка. ] соответствии с целью были определены следующие задачи исследования:
-
С помощью амбер-супрессорного мутагенеза получить широкий набо| мутантных белков с заменами аминокислот в N- и С- концевых домена; сигнального пептида щелочной фосфатазы.
-
-Изучить эффективность транслокации через цитоплазматическук мембрану мутантных белков с заменами положительно заряженного лизина N-концевого домена сигнального пептида щелочной фосфатазы на нейтральные у отрицательно заряженные аминокислотные остатки.
-
Провести систематическое изучение влияния аминокислотных замен расположенных в положениях -5, -4, -3, -2, -1 сигнального пептида щелочной фосфатазы, на процессинг этого белка.
Научная новизна работы. Применение амбер-супрессорного мутагенеза, основанного на подстановке аминокислот амбер-супрессорными тРНК в позицию соответствующую амбер-мутации в гене phoA, позволило получить большой набор новых мутантных форм щелочной фосфатазы Е. coli. В работе детально изучено влияние аминокислотных замен, расположенных в N- и С-концевых доменах сигнального пептида, на секрецию и процессинг этого белка. Показано, что эффективность транслокации щелочной фосфатазы через мембрану определяется природой аминокислоты в -20 положении N-концевого домена сигнального пептида. Проведенный стереохимический анализ комплекса "сигнальный пептид-фосфолипид" позволяет предположить, что эффективность секреции обеспечивается стабильностью комплекса, образуемого при инициации секреции. Анализ влияния аминокислотных замен, расположенных в С-концевом домене сигнального пептида, свидетельствует о важной роли структуры указанной области и представляет новое экспериментальное подтверждение правила "-3, -1". В настоящей работе 2
сазано, что для эффективного процессинга белка необходима определенная уктура аминокислотных остатков вне позиций -3 и -1.
Научно-практическое значение работы. Полученные в работе данные о іянии аминокислотных замен в N- и С- концевых доменах сигнального ітида щелочной фосфатазы на процессинг и секрецию этого фермента ширяют наше представление о механизме важнейшего клеточного процесса ;екреции белков. Несмотря на то, что настоящая работа относится к здаментальным исследованиям, использование амбер-супрессорного агенеза для получения мутантных белков может иметь также практическое чение. Этот подход особенно эффективен для быстрого скрининга большого ичества аминокислотных замен в экспериментах по белковой инженерии, дменение амбер-супрессорного метода для изучения секреции белков іественно расширяет границы его использования. Кроме того, в последнее мя все большее значение приобретает проблема вывода из клетки белков, дставляющих интерес для биотехнологии. В связи с этим данные о влиянии шокислотных замен на секрецию могут быть использованы при струировании векторных систем, позволяющих секретировать из клетки евые белки.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на сдународной конференции "Molecular genetics of bacteria and phages" (Cold ing Harbor, 1995), на 23-ей конференции FEBS (Basel, 1995), на (дународной школе "Molecular dynamics of biomembranes" (Cargese, France, 5), на конференции. "Биосинтез и деградация микробных полимеров, адаментальные и прикладные аспекты" (Пушино, 1995), на международной ференции посвященной памяти А,А. Баева (Москва, 1996), на симпозиуме >tein transport and stability" (Berlin, 1996), на Втором съезде Биохимического (єства РАН (Москва, 1997), на 17-ом Интернациональном Конгрессе по химии и Молекулярной биологии (San Francisco, USA, 1997) и на научных ференциях Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН щино, 1995, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора ;ратуры, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и ска литературы (202 ссылки). Работа изложена на 118 страницах, содержит 4 гицы и 26 рисунков.