Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Изучение репликационной структуры больших областей генома высших эукариот Вербовая, Лиля Витальевна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Вербовая, Лиля Витальевна. Изучение репликационной структуры больших областей генома высших эукариот : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.00.03 / Ин-т биологии гена РАН.- Москва, 1996.- 22 с.: ил. РГБ ОД, 9 97-4/3779-8

Введение к работе

Актуальность темы

Познание механизмов, контролирующих инициацию репликации ДНК в клетках высших эукариот, составляет одну из центральных задач современной молекулярной биологии. Быстрый прогресс в изучении участков начала репликации низших эукариот был предопределен установлением того факта, что определенный класс последовательностей ДНК способен поддерживать автономную репликацию плазмид в этих клетках. Эти последовательности (ARS-элементы) во многих случаях работают в качестве участков начала репликации и в хромосомах низших эукариот. К сожалению, данный экспериментальный подход не удалось применить для изучения участков начала репликации высших эукариот. Несмотря на многочисленные попытки идентифицировать последовательности ДНК способные поддерживать стабильную автономную репликацию ДНК в клетках млекопитающих и других высших эукариот, таких последовательностей обнаружено не было (за исключением последовательностей ДНК гомологичных участкам начала репликации ряда вирусов). В этой связи наиболее перспективным подходом для изучения участков начала репликации высших эукариот является картирование их позиций в охарактеризованных областях генома и последующее изучение функциональных элементов ДНК, локализованных в области инициации репликации. Изучение репликационной структуры тех или иных областей генома (т.е. картирование границ репликонов и участков начала репликации) представляется важным и для анализа ряда проблем, связанных с зависимостью времени

*

репликации геномных доменов от их транскрипционного статуса.

В настоящее время разработано несколько методов картирования участков начала репликации в охарактеризованных областях генома высших эукариот, таких, например, как анализ полярности синтеза лидирующих и отстающих цепей ДНК, анализ относительной представленности различных проб в препаратах коротких цепей новосинтезированной ДНК, и анализ направления движения репликативных вилок посредством различных элекрофоретических методов. Большинство из перечисленных выше процедур требуют предварительной синхронизации клеточной культуры. Кроме того они, как правило, позволяют проанализировать достаточно небольшую область генома. Исключением является лишь метод определения полярности синтеза лидирующих цепей ДНК. Этот метод в принципе может быть применен для анализа больших областей генома, не требует предварительной синхронизации клеточной культуры, и позволяет установить позиции как участков начала, так и участков терминации репликации, т. е. картировать организацию репликонов. в больших областях генома. Широкое применение данной процедуры для анализа репликационной структуры больших областей генома осложнялось однако необходимостью приготовления посредством трудоемких генно-инженерных манипуляций большого числа специальных проб, специфичных в отношении комплементарных цепей ДНК. В этой связи несомненной представляется актуальность темы настоящей

диссертационной работы, в которой предложена модификация метода анализа полярности синтеза лидирующих цепей ДНК, значительно упростившая этот метод и впервые позволившая проанализировать репликационную структуру неамплифицированной области генома человека, имеющей протяженность более 2000000 п.н. и содержащей самый длинный из охарактеризованных генов - ген мышечной дистрофии Дюшенна. Сравнительный анализ репликационной структуры гена мышечной дистрофии в различных клеточных линиях, в том числе в клеточных линиях, содержащих перестроенные варианты этого гена позволит проанализировать взаимосвязь между репликационной структурой этого гена и топографией хромосомных перестроек, часто происходящих внутри данного гена.

Цели и задачи работы

Целью данной работы явились разработка модифиикации метода определения направления синтеза лидирующих цепей ДНК, которая позволила бы использовать данный метод для анализа репликационной структуры больших областей генома, и картирование с помощью данной процедуры топографии репликонов в протяженной (2000 т.п.н.) области генома человека, включающей ген мышечной дистрофии Дюшенна. Для -достижения данной цели нами были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать условия, обеспечивающие возможность использования коротких синтетических олигонуклеотидов в качестве специфичных в отношении цепей ДНК проб для

количественного анализа соотносительной представленности различных уникальных последовательностей в препаратах новосинтезированной ДНК.

  1. Проверить возможность использования олигонуклеотидных проб для анализа полярности синтеза лидирующих цепей ДНК посредством картирования участка начала репликации в участке генома, репликационная структура которого была изучена ранее с помощью иных эксперементальных подходов.

  2. Охарактеризовать топографию репликонов в границах гена мышечной дистрофии с использованием олигонуклеотидных проб, синтезированных на основании известной нуклеотидной последовательности экзонов этого гена.

Научная новизна и практическое значение работы.

Разработана модификация метода определения полярности синтеза лидирующих цепей ДНК, позволяющая использовать данный метод для изучения репликационной структуры частично охарактеризованных больших областей генома без их предварительного клонирования и субклонирования. Данная процедура может найти широкое применение при изучении комплекса проблем, связанных со структурно-функциональной организацией эукариотического генома, взаимозависимостью транскрипционного и репликационного статуса доменов эукариотического генома и механизмами хромосомных перестроек.

Охарактеризована топография репликонов в наиболее протяженном из известных человеческих генов - гене мышечной дистрофии Дюшенна. Впервые продемонстрировано, что один ген может быть организован в несколько репликонов. Впервые продемонстрировано, что в клетках высших эукариот репликоны могут быть ассиметричными. Картирование топографии репликонов в гене мышечной дистрофии Дюшенна представляется весьма важным для изучения механизмов хромосомных перестроек, часто происходящих в границах этого гена и приводящих к тяжелым наследственным заболеваниям человека.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы представлялись на Гордоновской конференции, посвященной ядерным белкам, структуре хроматина и регуляции транскрипции (США, 1996), а также на научных семинарах в Институте им. Ж. Моно (Франция, 1996), Университете г. Гамбург (Германия, 1996), Университете г. Сан-Луис (США, 1996) и Национальном Институте Здоровья (США, 1996) .

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на >5 страницах

машинописного текста и состоит из следующих частей:

"Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Библиография включает источников. Работа проиллюстрирована рисунками и Я, таблицами.