Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание трансгенных животных привело к интенсивному развитию в течении последних 15 лет нового направления в биотехнологии - эмбриоинженерии, базирующегося на достижениях молекулярной биологии, генной инженерии, эмбриологии. В настоящее время созданы линии трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных, которые используются как продуценты некоторых биологически активных веществ в фармакологии, в качестве моделей для изучения различных заболеваний и в других областях биотехнологии.
Для получения трансгенных животных сейчас наиболее широко применяют такие технологии, как микроинъекция в пронуклеус зиготы, использование рекомбинантных ретровирусных векторов, липосом, эмбриональных стволовых клеток. Но несмотря на значительные успехи данных методов в получении трансгенных животных, проблема низкой выживаемости эмбрионов, составляющей 10-20%, низкой эффективности переноса и интеграции чужеродного генетического материала, составляющей 0,2-5%, при высокой трудоемкости методов не решена и сегодня. Особенно актуален вопрос об эффективности существующих технологий переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки при получении трансгенных сельскохозяйственных животных, так как эмбрионы коров, овец, свиней не обладают прозрачной цитоплазмой и для определения локализации пронуклеусов перед микроинъекцией необходимы специальные предварительные манипуляции с зиготами. Кроме того, следует учитывать большие материальные затраты при получении трансгенного животного: например, стоимость трансгенного теленка достигает 500.000$.
Поэтому одна из задач современной генной эмбриоинженерии-создание метода, позволяющего снизить трудоемкость процесса введения чужеродной ДНК в эмбриональные клетки млекопитающих доимплантационных стадий развития.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и изучение нового метода переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки, основанного на использовании механизма рецептор-опосредуемого эндоцитоза, позволяющего снизить трудоемкость способа доставки чужеродной ДНК, а также в изучении возможности вводить различный генетический материал в составе ДНК-переносящей конструкции на основе применения одних и тех же компонентов. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
-
Разработать способ, позволяющий использовать рецептор-опосредуемый эндоцитоз для введения чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки млекопитающих in vitro.
-
Определить эффективность трансгенеза с помощью ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы млекопитающих доимплантационных стадий развития in vitro.
-
Разработать способы доставки ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей доимплантационнных стадий развития, не извлекая их из организма беременной самки.
4. Проанализировать состояние введенного чужеродного
генетического материала в геноме эмбрионов на разных стадиях
эмбриогенеза и у новорожденных.
Научная новизна и практическая значимость. Методом рецептор-опосредуемого трансгенеза было получено 24 эмбриона мыши постимплантационных стадий развития и один новорожденный с перенесенной чужеродной ДНК.
Впервые было показано, что рецептор-опосредуемый транспорт чужеродного генетического материала может быть применен не только для трансгенеза соматических клеток и тканей, но и для эмбрионов млекопитающих первых дней жизни.
Показана высокая эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей, кроликов на стадиях зиготы, 2-бластомеров, морулы и бластоцисты и в эмбрионы овец на стадии морулы.
Установлено, что ДНК-переносящая конструкция не является токсичной для эмбрионов и выживаемость составляет 70%-90%, как и у контрольных животных, при культивировании in vitro.
Показано, что включение в состав ДНК-переносящей конструкции аденовирусов, способствующих выходу ДНК из эндосом, значительно облегчает процесс доставки генетического материала к ядру эмбрионов доимплантационных стадий развития.
Проведенные эксперименты показали возможность получения трансгенных животных непосредственно при введении ДНК-переносящей конструкции в организм беременной самки за счет транспорта чужеродного генетического материала в эмбрионы в полости организма, что, соответственно, повышает выживаемость эмбрионов.
Работа представляет не только научный, но также имеет практический интерес, так как разработанный метод доставки чужеродного генетического материала в эмбрионы, использующий механизм рецептор-опосредуемого эндоцитоза, может быть в дальнейшем использован для введения рекомбинантого гена в эмбрионы сельскохозяйственных животных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего библиографических ссылок. Работа представлена на 113 машинописных листах, включая 5 таблиц и 25 рисунков.