Введение к работе
Актуальность проблемы
Рстровирусы часто вызывают разнообразные неопластичсскис, а также иммупо-дефицитные заболевания у позвоночных, включая человека. Вирусы этой группы в настоящее время широко используются как молекулярные векторы для переноса и экспресош генетического ;атернала в клетках эухариот. Лечение ретровирусных заболеваний и создаїше ретровирусных векторов основано на зншшн молекулярной биологии этой группы вирусов. Тем не менее, многие детали молекулярных механизмов репликации все еще остаются неизвестными. Изучите отдєльііьіх этапов размножения, а также цис- и транс-действующих факторов, вовлеченных в этот процесс, позволит боле-; глубоко понять особенности репликации ретровнрусного генома, идентифицировать удобные мишени для антивирусной терапии, а также создать ретровирусные векторы с новыми свойствами.
Отличительной особенностью ретровнрусов является наличие в их жизненном цикле процесса обратной транскрипции, в результате которого на матрице геномной РЫК сгаггезирустся ДНК-провирус, интегрирующий затем в геном клетки-хозяина. Для репликации Ретровнрусного генома требуется несколько цне-действующих последовательностей: длшпале кмщевые повторы (LTR, long terminal repeat), содержащие промотор и знхансер транскрипции, сайт и сигнал полиадешмироваїшя, а'также инвертированные повторы на 5' и 3' концах (IR, inverted repeat); последовательность, комплементарная т-РНК затравке для праймирования .синтеза мшгус-цепи ДНК-провируса (PBS, primer binding site); полшгуриновый тракт (PPT, polypurine tract), который является сайтом ишпдаации сшггеза плюс-цепи ДНК-провируса; область упаковки-димеризацин (у или Е), отвечающая за специфическую упаковку геномных РНК в вирион и их димеризацию (Varmus, 1985).
Последовательность ретровнрусного генома, вовлеченная в специфическую упаковку вирусных РНК, была обнаружена около 5' конца генома у целого ряда ретровнрусов (Aronoff and Linial, 1990). Для вируса лейкемии мышей Молони сигнал упаковки или у область вначале был обнаружен в районе между донорным сайтом сплайсинга и гапщиирующим кодоном гена gag (Mann et al, 1983). Впоследствии, дополнительные сигналы упаковки MoMuLV были найдены в gag-кодирующей последовательности и 5' участке V5 района LTR. (Bender et al, 1987; Murphy and Goff,1989). Взаимодействия между этими тремя сигналами упаковки остаются невыясненными. Оіш могут служить независимыми сигналами упаковки или
4 образовывать общую вторичную сгруктуру, которая я распознается вирусными белками.
Другой особенностью ретров!1русов является налігше в их вирионах двух идентичных копий РНК, которые нековалентао соедіпісим между собой «а 5' концах при помощи структуры, названной DLS (dimer linkage structure). У большинства рстровирусов DLS картируется в районе, который перскрьгоастся с областью упаковки или у областью. Функции DLS в жизненном цикле регровирусов не известим, но предполагается, что DLS и ч» область принимают участие в упаковке вирусных РНК, так как DLS и ці область контролируются одной и той же цис-денствующей последовательностью (Bender et al, 1976; JvJurti et al, 1981; Prats et al, 1990).
Хотя рстровирусный вирион содержит две геномные молекулы РНК, он продуцирует только одни провирус (Panganiban and Fiorc, 1983; Ни and Temin, 1990). Эта данные позволяют предполагать, что, либо обе геномные молекулы РНК вовлечены в синтез одного ДНК-провируса, либо инициация обратной транскрипции может происходить только на одной in двух молекул РНК. В настоящее время существуют досгаточно противоречивые данные, полученные in vivo, І) ОПІОШСІШИ того, сколько молекул РНК вовлечено в синтез ДПК-провнруса (Panganiban and Fiore, 1938; Jones et al, 1994). Однако, в экспериментах in vitro было показано, что, как это теоретически и предпологалось, синтез провируса как на одной, так и двух РНК-матрицах происходит с равной вероятностью (Allain ct al, 1994). Исходя из этого можно
ПреДПОЛОЖИТЬ, ЧТО В УСЛОВИЯХ ІП Vivo СуЩССТВуСТ ЫеХаННЗМ, КОТОРЫЙ ІІШіршишсї ciuuo
провируса на двух матрицах РНК.
В течение последних десяти лет ретровирусы широко применяются как векторы для введения и экспрессии генов, мечекия клеток, получения кДНК-овых копий генов, создания трансгенных животных, а также целей генной терапии позвоночных, включая человека. Преимущественное использование ретровнрусных векторов связано с особенностями их жизненного цикла и организацией генома; 1) ретровирусы способны стабильно интегрировать в геном клетки-хозяина; 2) относительно небольшие размеры генома позволяют легко с шш манипулировать in vitro; 3) внутренние последовательности рстровирусного гепома могут быть удалены таким способом, что все функции, необходимые для репликации, будут предоставлены in trans; 4) используя пакующие клеточные линии с широким спектром хозяев, гибридными рстровирускыми вирионами можно инфицировать практически любой вид и тіш клегок позвоночных. В представляемой работе ретровирусные векторы использовались для маркирования гиоридомкых клеточных линии с целью получения гибрида гибридом (хввдром),
продуцируюпдих биспецифические аігпггела.
Целью исследования, являлось пэученепе влияния рстровирусных последовательностей, расположенных между длинными концевыми повторами, на репликацию и упаковку ретровнрусных всігторов и их пспольїование для переноса доминантных селективных генов с целью получсішя межклеточных гибридов.
Задачи работы:
1.Получил, "минимальные" ретровирусньїе векторы на основе вируса лейкемии мышей Молони (MoMuLV), у которых отсутствуют внутренние последовательности генома.
2.Изучіггь способность этих векторов принимать участие в репликации.
З.Исследовать структуру провируса, синтезированного на матрице РНК "минимального" рстровирусного вектора.
4.0пределнть, какое количество провнрусов продуцирует один тіфекцпошімй віірион, содержащий "минимальные" ретровирусньїе геномы .
5.Изучить возможность конкуреншш между у* н у ' геномами за белки внрноно» в пакующей клеточной ліпшії u/2.
6. Исследовать влияние U5 района LTR на упаковку н репликацию рстровирусного генома.
7.Изучить эффективность маркирования клеток гибридом при помощи ретровнрусных векторов, кодируюпцех различные доминантные селективные маркеры.
Научная новизна
Полученные результаты показывают, что ретровирусньїе векторы, у которых отсутствуют внутренние последовательности генома, способны принимать участие в репликации и продуцируют провирусы, имеющие корректную структуру. Эги донные позволяют сделать заключите, что внутренние последовательности рстровирусного генома являются не обязательными для репликации, так как "минимальный" ретрови-русный геном может использоваться как естественная матрица для обратной транскрипции. Внутренние последовательности рстр.'вирусов, вероятно, не контролируют сшггез провируса на двух матрицах РНК, поскольку каждый инфекпнонш.ііі вирной, содержащий "минимальные" геномы, продуцирует только один провнрус.
U5 район LTR и gag-последователъность прштмают участие в упаковке тош.ко в присутствии >v области. Это показывает, что gag-последователыюсть я Ш раііон
повлечены в образовште общих вторичных структур с \у областью, которые распознаются вирусными Сохами как дополнительные сигналы упаковки.
В экотропной пакующей ліпшії \u2, ц/( иу" геномы не конкурируют за белки вирноиов. Отсутствие конкуренции, вероятно, связано с тем, что упаковка геномных молекул РНК не лимитирована количеством вирусных белков, вовлеченных в специфическое связывание нуклеиновых кислот и формирование вириоиов.
Сравнительный анализ показал, что перенос доминантных селективных генов при помощи ретровирусных векторов позволяет быстро и эффективно осуществлять мечение клеток с целью их дальнейшего использоваши для получешія межклеточных гибридов.
Практическая значимость
В этой работе получены новые сведения о цис-действующих последовательностях ретровирусного генома, вовлеченных в репликацию и упаковку вирусных РНК. "Минимальные" векторы могут быть использованы как модельная система дпя дальнейшего изучения цне-денствуюппк элементов ретровирусного генома, которые являются важными для репликации, экспрессии, иптеграціш, формировании дйплоидности и других этапов жизненного цикла рстровнрусов.
Предложенный в настоящей работе метод мечения клеток при помощи ретровирусных векторов, кодирующих доминантные селективные гены, может использоваться для маркировки широкого спектра клеток позвоночных, включая клетки человека, что позволит быстро и эффективно получать межклеточные гибриды.
Положите, выносимые на защиту
"Минимальные" ретровирусные векторы, не содержание внутрешшх последовательностей генома, способны реплицироваться. Каждый инфекционный внрион, содержащий "минимальные" ретровирусные геномы, продуцирует только одни провирус, который имеет коррекпгую структуру.
U 5 район LTR и gag-последовательность не являются автономными сигналами упаковки.
у* и ху - геномы вируса лейкемии мышей Молони не конкурируют за белки вириоиов в экотропной пакующей линии vj/2.
Перенос доминантных селективных генов при помощи ретровирусных векторов является простым и быстрым методом мечения клеток с целью создания межклеточных гибридов.
Ліірободпя iiwtttpiaitmi
Мтсрналы роботи били доложены на Международной конференции "Спид, рик и реіровнруси человека" (Санкт-Петербург, Россия, 1992), а также IV съезде иммунологов и аллергологов Республики Беларусь (Гродно, 1995).
Публикации
Материалы диссерт». ни опубликованы в б научных работах.
ОСгьем и структура диссертации
Диссертация включает введение, главы "обзор литературы", "материалы и методы", "результаты", "обсуждеіше", выводы. Работа изложена на 77 страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков, 4 таблицы я список использованных источников из 100 наименований.