Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее злободневных проблем довременной токсикологии является нешучешюсть молекулярных механизмов патогенеза отравлений грибными ядами. С отмеченной тонкії зрснш; особый пггтерсс представляют пищевые отравления, ядами микроскопических гги:бсс рода Фузарпум, в частности, так называемым микото;:сшш;з зеаралеиоію.ч, ігвляїоіптяіся крайне токсическим соединением, загрязняющим главным образом злаковые культуры. Природа патологических проявлений, формирующихся на фона поражений пищевыми контаминантамн, в том числе и мнкотоксішами различного профиля дейстшія, характеризуется мутагенными, тератогенными, аллергогешшмн. канцерогенными, нейротропными и многими другими эффектами, н том числе и различными расстройствами деятельности отдельных органов, систем и внутренней среды организма (Осишщ Л„ 1997).
Согласно статистическим указаниям многих американских, европейских,, африканских и азиатских стран (Christensen С, 1979) большинство массовых, алиментарных токсикозов имеет в своей основе поражение пищевых продуктов пнкотокашом зеаралеионом (Мігосиа С. et аі., 1984).
Отдаленные результати последствий тяяселых отравлений грибными ГФ,ами не могут не коснуться пркчшшо-следсгв&шшх негативных сторон многих демографических отклонений (Осышш Л.,' 1997) и іго:,ії^:іі2у:.:гл:±с.і ьспросов устоіїчивости фактора человеческого раэкгшд (Дшисдгаї 1С, 1SQ.
Поскольку зеароленон, предстаглаюигай cgCdD лсїпгсл резарциловой гагслоты, является производным гормонов-эехрогеноз, то было бы логичным предположить сходство в эффектах указанных соединений на организм Человека и животных, d частности, в плане интенсификаци процессов анаболизма катехолампіюв (Panek et а!., 1986). При этом уместна попытка іштерпретиросатії проявляющийся эффект в свете современных представлений по принципиально позым закономерностям взаимодействия биологических объектов со сверхмалыми дозами биологически активных соединений {Бурлакова Е., 1S94). 1С сожалению, по сей день остаются мало освещенными молекулярные г.лашимы натгенеза токсических наражений зеараленоиом п отоиюиш: і.ач .и'.есксло аппарат, а частности процессов экспрессии
4
тггрсзішпїдроксплазм и дофадекарбоксилазы {Фетисов С, 1994), а также
отклонений метаболизма липоидов на уровне хроматина и ядерной мембраны
чимои.п'гсг» (Кулагина Т., 1904). В связи с этим отсутствие сведений об
эффективности ингибиругощего действия соответствующих антител как
высокоспецифических, полуфункцноналшых блокаторов значительно
затрудняет поиск эффективных мер борьбы с этим недугом. В подобной
постановке вопроса назревает необходимость изучения особенностей
расстройств метаболизма тех важнейших биологических систем клетки,
которые ответственны за бесперебойность функционирования механизмов
транспорта веществ внутрь клетки и из нее во внеклеточное пространство.
Находясь в постоянной зависимости от функционального состояния
нейроэндокршшого аппарата, в частности от настроя
катехолашшобразовательных процессов (Winkler Н. et al„ 1986; Schwarzenbrunner U. et al., 1990), конечные эффекты зеараленоновых отравлений характеризуются, подчас, необратимостью нейропаралитических проявлений и гибелью организма, во многом обусловленной концентрацией поступившего в него яда. Последней придается важное значение в изменениях активности ферментных систем и индивидуальных белков типа медьсодержащего белка кислой природы (Helle К., et al., 1978),. участвующих в биосинтезе катехоламинов, главным образом видоспецифичкекой дофамин-р-монооксигеназы (Bon S. et al., 1991), катализирующей, как известно, процесс гидрокислирования дофамина с трансформацией его в норадреналин (Scotland Т. et al., 1979; Winkler Н. et al., 1986; Stewart L. et al., 1988; Schwarzenbrunner U. et al., 1990). Гликопротеидная природа фермента (Scotland f. et al., 1979) не подкреплена до сих пор дополнительной научной информацией относительно характера комплексования входящих в его строение маннозы, галактозы, N-глюкозамина и сиаловых кислот с молекулой белка, помимо известной глюкозиднои связи между этими углеводами и амидными группами (Wang N.. et al., 1990; Wong D., et al., 1990).
Из существующих двух разновидностей дофамин-р-монооксигеназы -растворимой (цитозольной) и мембраносвяэашюй, особый интерес возбуждает последняя (Бояджян А., 1996; Пегросян С. Ам., 1996; Погосян А.. 1996), отличающаяся известным урові. ,-м гидрофобности, обусловленной присуствием
в ее строении гидрофобного белка, состоящго из 22 аминокислотных остатков способствующего его трошюсти к мембране хромаффннншх гранул (Fukeda ' et al., 1994). С другой стороны, отмеченное сродство фермента к мембран {Gibson К. et al., 1993), по всей вероятности, обусловлено также обнаруженным в структуре фермента кислыми и нейтральными фосфолшшИдами ( Saxena А. і el., 1983; Stewart L. et al., 1988) среди которых фосфотидилсершшм придает* Езрпостеїїеп;;ог значение (Taylor С. et al., 1989} как наиболее активним реализации: ассоциативной связи между ферментом и мембрзи: хромаффшшых гранул. Следовательно, делипидтандя мембран, досшгагк. хлороформ-механоловой экстракций фосфоліілидов мембран, сопровождает инахтвацней фермента (Saxena A. et а!., 1983), лкпидзавнсимость которо иотдверждается развивающимся при этом нарушением фнлотеиеткчгс стабилизированного постоянства качественного набора и колкчестванкс содржания фосфолипидов в данной биологической системе. В. аккумулирован і; трансформации энергии п биологических мембранах (Скулачеа В.,. 1969, 197 реализации высоких уровней энергии взаимодействия природных. (Храпова !S8!j и синтетических ашиоксидантов с перекиспыми радикалами .(Гаркшзї Т., 1979; Храпова Н., 1931; Бурлакова Е., 1994; Салганик P., 1S94; Донченко Г др., 1982, 1983, 1985 а, б) и, наконец, в обеспечении физиологичен активности клетки в целом (Крепе Е.,1967, 1981; Бурлакова Е. и др., 1981, 198' б) исключительно важна бесперебойность процессов трансмембранн переноса веществ и синхронность в функционировании мембранноевкзанн лі? независимых протеинов - ферментов и рецепторных белков.
Вышеизложенное акцептирует неизбежность изучения особенное вредоносного действия мнкотоксина зеаралеиопа на функциональное состоя важнейших субклеточных образований головного мозга, печени - митохонд; макросом, их наружных и внутренних мембран, а также мембран эритрощ и лимфоцитов как важнейших показателей состояния функции хроветворе: имлгуиологпческой, аатиоксидантной реакции и гипоксического состоя организма (Донченко Г. и др., 1982, 1933, 1985 а, б; Капралов А. и др., 1994). всей вероятности, расстройства в отмеченных сферах жизнедеятелыгасп различных уровнях организации клетки, молниеносно" разыгрьшаюидкесг
фоне зеараленоповых отравлний, выступают ц роли главного патогенетическою фактора в быстром назревании необратимых нарушений с летальным исходом.
Цель п основные задачи исслелопания Принимая во внимание -
паралитическое действие токсикозов различной природы, в частно'сти
отравлений грибными ядами, на структурно-функциональное состояние живой
клетки, интенсивность течения в них жизненно важных биохимических н
молекулярно-биологических процессов, обуславливающих бесперебойность
функционирования систем трансмембранного переноса веществ, трансдукцин
внешнего сигнала внутрь клетки (Pelech S. et al, 1989; Асатрян Л., 1993;
Тадевосяк Ю., 1996) и аффинности рецепторов к своим лигандам, мы' задались
целью проведения специальных исследований. Они в основном развивалсь в
направлении изучения особенностей нарушения качественно-количественных
показателей метаболизма фосфолипидов в мозговой, печеночной тканях,
зріпроціїтах и лимфоцитах белых крыс в различные сроки отравления
микотохстгом зеараленоном. Вместе с тем преследовалась также цель по,
изысканию наиболее эффективных мер борьбы с последствиями
метаболических нарушений в направлении интенсификации
свободдорадикалышх реакций, развивающихся на фоне интоксикации (Салганик Р. и др., 1994), и обеспечению нормализации расстроенных сторон метаболизма фосфолипидов. Особое внимание будет уделено .некоторым аспектам молекулярно-клеточной регуляции дыхательной функции митохондрий (Корнеев А. и др., 1994; Элбакидзе Г, и др., 1994).
Для осущесталиия отмеченных целей были запланированы следующие, 'задачи настоящего исследования по изучению;
-эффектов зеараленона на активность дофамин-р-монооксигеназы, ее физико-химических свойств, количественных изменений хатехоламинов в мозговом слое надпочечников;
-динамики активности дофамин-р:монооксигеиазы в хромаффинных . гранулах мозгового слоя надпечечников при действии зеараленона;
-сдвигов структурно-кинетических параметров электрофоретнчески гомогенных препаратов цитозолыгой и мембраносвязанной форм дофамнн-Р-монооксигеназы при зеаралежн. овых отравлениях;
-методов получения полинеспецифичесхих антител к зоараленоиу и использования их с целью нейтрализации признаков отравления;
особенностей нарушения обмена фосфолипидов, приводящего к их качественным и количественным изменениям, расстройств сдвигов интенсивности течения реакций свободнорадикалыюго окисления липидов в митохондриальной и микросомальной фракциях мозговой и печеночной тканей, в наружных и внутренних мембранах этих образований, равно как и в мембранах эритроцитов и лимфоцитов при зеараленоновом токсикозе;
-природы токсических эффектов зеараленона в формировании срывов
резистентности этитроцитов к переписному гемолизу, .
-роли зеараленона в патогенезе нарушений процессов окислительного фосфорилирования d митохондриальной фракции головного мозга и печени;
-специфики нивелирующего действия тиосульфата натрия па
метаболические нарушения фосфолипидов в отмеченных образованиях клетки
и роли этого антиоксидднта в нормализации фосфолипд-фосфолипидных
взаимоотношений и лимитировании гаггенсивности течения процессов
свободнорадикального окисления липидов в различные периоды
зеараленонового отравления; -
-токсического действия зеараленона на процесс фиксации кислорода,
реакцию этерификации неорганического фосфата и изменения величины
коэффициента Р/О в митохондриях 'исследованных тканей и нормализующих .
эффектов свободного этаноламина, этаноламиифосфата и
фосфатидилэтанолзмина. V
Научная новизна работы. На основании результатов впервые предпринятых фундаментальных исследований по изучению молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксина зеараленона в эксперименте на белых крысах представилась возможность выявить и .интерпретировать следующие феномены, касающиеся конкретных вопросов фосфолипидного метаболизма на уровне субклеточных образований, их наружных и внутренних мембран мозговой и печеночной тканей, а также мембранных образований эритроцитов крови и лимфоцитов" селезенки. Установлены :'
-стимулирующее действие зеараленона на активность фосфолипазы Aj с
интенсифик. дней процессов деацилирования мемї адносвязанных'
8 фосфолипндоп, сопровождающихся выходом значительных концентрації лизофосфатидилхолинов, неэсторифицированных жирных кислот полиеномм-ряда, интенсивно вовлекающихся в реакции свободнорадикальцого окисление как в неферментативной (аскорбат-зависнмой), так и ферментативной (NADP.H-зависимой) системах окисления;
-стимулирующее действие зеаралекона в дозе 1-15 мкг/мл на реакции
катехоЛаминобразования и, наоборот, ингибирующее влияние его более
высоких концентраций на отмеченный процесс, реализуемые через
молекулярные изменения активности дофамин-р-монооксигеназы,
катализирующей реакцию гидроксилирования дофамина с образованием норадреналина, метилирующегося в адреналин;
-взаимосвязь и взаимообусловленность между активированием процессов биосинтеза катехоламинов, высокие уровни которых способствуют активации реакций деацилирования фосфолипидов при участии фосфолипазы А2 с развитием мембранотоксических и мембранолитических эффектов, обусловливающих гибель данной биологической системы и организма в целом;
-метаболическая связь между нормализующим действием свободного этаноламина, зтаноламинсодержащих эфиров и фосфатндилэтаноламинов в упорядочении реакций окислительного фосфорилнрования в митохондриях мозговой и печеночной тканей в развитии зеараленонового токсикоза;
-патогенетическая роль срывов в резистентности эритроцитов к перекислому гемолизу как одному из решающих тревожных факторов, ведущих к необратимому наступлению летального исхода.
Практическое значение работы. Факт чрезмерного развития интенсивности течения реакций свободнорадикального окисления липидов на уровне исследованных биологических систем клетки под действием микотоксина зеараленона послужил основанием к испытанию эффектов тиосульфата натрия на фоне отравлений зеаралеї: 'ном различной продолжительности. Полученные результаты по степени своей выраженности и эффективности убеждают в необходимости неотлагательной рекомендации использования тиосульфата натрия как мощного антиоксиданте при данной патологии. Согласно проведенным наблюдениям тиосульфат натрия ок.пмвает н,іі]бо\ео демонстративно проявляющее-і Гпагмгнорпое денемте при
9 .Использовании его п первые 2 часа зєараленоиового отравления. Более того, 'введения зеараленона экспериментальным животным, предварительно і .инъецированным тисульфатом натрия, характеризуются полнейшим ; нивелирбванием признаков зєараленоиового токсикоза, что проливает существенный свет на понимание молекулярных механизмов нормализующего Действия тиосульфата натрия на биологические системы клетки, ответственные ^за/физиологичность его функционирования.
Вышеизложенное позволяет рекомендовать тиосульфат натрия к ццірокому исйользованию в качестве весьма эффективного и перспектйь.юго лечебного фармакопейно принятого препарата при токсикозах различного происхождения вообще и зеараланоновых отравлениях в частности.
Основные положения диссертации, выносимые на зашиту: -формирование молекулярных механизмов токсического действия зеараленона на физико-химические п функциональные свойства дофамин-р-монооксигеназы и о связи с этим, особенностей хатехоламинобразовательной функции организма;
-эффекты .зеараленона в изменениях качественного спектра и количественного содержания индивидуальных фракций фосфолипидов, суммы их нейтральных и кислых представителей, фосфолипид-.фосфолипидных взаимоотношений в различных клеточных образованиях мозговой и печеночной тканей, а также в эритроцитах и лимфоцитах селезенки;
-стимулирующая роль зеараленона в интенсификации реакции своб.\д,норадикалЫ1ого окисления липидов и понижении резистентности эритроцитов к переписному гемолизу;
-значение тиосульфата натрия как мощного соединения антиоксидантного действия в нивелировании зєараленоиового отравления, упорядочении и поддержании филогенетически стабилизированного постоянства" фосфолипид-фосфолипидных взаимоотношений на различных уровнях организации клетки;
/^юль свободного этпноламииа, этаноламии'фосфата и
фосфагидклэтаноламина ' в -нормализации процессов окислительного
фосфорилирования в митохондриалыгой фракции, исследованных тканей -в
условиях зсаралемоновых отравлений.
Структура диссертации. Диссертация представленна на 123 страницах русского текста, состоит из оглавления, введения, 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка цитированной литературы (159 русских и 131 иностранных источников), 34 рисунков и списка использованных сокращений.