Введение к работе
Актуальность темы. Одно из основных направлений молекулярной биологии - изучение механизмов экспрессии генетической информации. Первый этап генетической экспрессии, транскрипция, осуществляется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Наболес изученным ферментом транскрипции является РНК-полимераза Escherichia coli. Это сложный белковый комплекс с молекулярным весом 450 kDa, состоящий из кор-фермента (о^РР'), обладающего каталитической активностью, и сг-субъединицы, необходимой для специфичного узнавания промоторов и эффективной инициации транскрипции. РНК-полимеразы других бактерий имеют сходное субъединичное строение. Более того, аминокислотные последовательности гомологичных субъединиц обнаруживают в своём составе ряд эволюшюнно-консервативных районов, расположенных в одинаковой последовательности, что указывает на общую структурную организацию всех бактериальных РНК-полимсраз.
Изучение роли отдельных субъединиц в составе РНК-полимеразы и исследование её структурно-функциональной организации, а также изучение механизмов транскрипции являются взаимосвязанными задачами, решение которых необходимо для понимания процесса экспрессии генов. Наши знания о функциональной роли различных участков субъединиц РНК-полимеразы весьма ограничены. Мультисубъединичное строение и большие размеры РНК-полимеразы затрудняют применение прямых структурных методов для изучения фермента. Поэтому одним из основных подходов к изучению функционирования РНК-полимеразы является применение генно-инженерных и биохимических методов, а именно, получение мутаций в генах субъединиц РНК-полимеразы и исследование свойств мутантных ферментов.
Цели работы и задачи исследования. Целью данной работы являлось
выяснение функциональной роли СООН-концевого эволюционно-вариабельного района Р'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli и структурной организации РНК-полимеразы патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori. В работе ставились следующие задачи: (а) картирование антигенной детерминанты и изучение механизма подавления транскрипции моноклональными антителами, взаимодействующими с Р'-субъединицей РНК-полимеразы Е. coli; (б) исследование
функциональной роли протяжённого эволюционно-вариабельного района р'-субъединицы при помощи делеционного мутагенеза и изучение свойств полученых мутантных ферментов in vitro; (в) выделение РНК-полимеразы из штамма 26695 Helicobacter pylori; (г) определение и сравнение последовательностей участков стыковки генов гроВС иротеобактсрий, родственных Helicobacter pylori.
Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что протяжённый СООН-концевой эволюционно-вариабельный район Р'-субъсдиницы не является необходимым для основных каталитических функций РНК-полимеразы Е. coli in vitro. В гене гроС получен ряд перекрывающихся делеций, приводящих к уменьшению скорости элонгации транскрипции мутантными ферментами Для одного из полученных мутантных ферментов показано, что делеция в вышеуказанном районе Р'-субъединицы понижает эффективность расщепления РНК-продукта в тройном элонгационном комплексе. Впервые выделена РНК-полимераза из патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori, и показано, что Р и Р'-субъединицы данного фермента представляют собой единый полипептид. Установленно, что слияние генов гроВС характерно для всех исследованных в данной работе бактерий, принадлежащих роду Helicobacter. Показано, что р и Р'-субъединицы РНК-полимераз бактерий, принадлежащих родам Campylobacter и Arcobacter кодируются двумя генами (гроВ и гроС ), причём эти гены не разделены спейсером, как характерно для большинства изученых бактерий, а перекрываются.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их
обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на
страницах машинописного текста и содержит рисунков и таблиц
Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.