Введение к работе
Актуальность проблемы. мРНК в цитоплазме клеток эукариот всегда связана с белками и образует рибонуклеопротеидные частицы (мРНП или информосомы) (Spirin et al., 1964; Spirin, 1966; 1969). Белки, ассоциированные с мРНК, контролируют ее активность в белковом синтезе, время жизни в клетке и внутриклеточное распределение (Spirin, 1996). Белки мРНП можно разделить на специфические, ассоциированные с определенными мРНК, и универсальные, связанные с большинством или всеми мРНК клетки. К последним принадлежит белок р50 - мажорный коровый белок цитоплазматических мРНП соматических клеток. На основании первичной структуры и способности специфически взаимодействовать с Y-box содержащей ДНК этот белок был также идентифицирован как член- семейства Y-box связывающих факторов транскрипции. р50 был обнаружен в ассоциации как с транслируемой мРНК полирибосом, так и с нетранслируемой мРНК свободных мРНП (Minich & Ovchinnikov, 1992; Minich et al., 1993). Было показано, что при небольшом соотношении р50/мРНК, что имеет место в полирибосомах, белок стимулирует трансляцию на стадии инициации, в то время как при более высоком соотношении р50/мРНК в свободных мРНП он репрессирует трансляцию (Minich et al., 1989; 1990). Было также показано, что р50 фосфорилируется in vivo и in vitro (Minich et al, 1993). Мы предположили, что фосфорилирование может изменять сродство этого белка к мРНК и, таким образом, изменять его содержание в мРНП.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена исследованию фосфорилирования белка р50, как возможного регуляторного механизма, контролирующего переход мРНК из нетранслируемого в транслируемое состояние. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: (1) экспрессировать р50 в E.coli; (2) выделить р50 из E.coli и сравнить его свойства со свойствами белка из мРНП ретикулоцитов кролика; (3) исследовать свойства протеинкиназы, фосфорилирующей р50 в лизатах ретикулоцитов кролика, и ее распределение в субклеточных фракциях; (4) определить число и положение в полипептидной цепи аминокислотных остатков р50,
фосфорилируемых в лизате ретикулоцитов; (5) исследовать влияние фосфорилирования р50 на его взаимодействие с мРНК и ДНК.
Научная новизна работы. В результате проделанной работы получен штамм E.coZt - суперпродуцент белка р50 и разработан метод выделения рекомбинантного белка. Показано, что белок, экспрессированный в Е.соїі, не отличается от р50 из ретикулоцитов по всем исследованным свойствам. Исследовано распределение р50-протеинкиназной активности во фракциях лизата ретикулоцитов кролика и изучены ее свойства. Определена стехиометрия фосфорилирования in vitro р50 из Е.соїі и из полирибосомных и свободных мРНП, определено положение фосфорилируемых аминокислотных остатков в молекуле белка. Несколькими методами показано, что в результате фосфорилирования уменьшается сродство р50 к нуклеиновым кислотам; определена константа связывания фосфорилированного и нефосфорилированного р50 с мРНК и Y-box ДНК.
В целом, полученные в этой работе результаты позволяют по-новому взглянуть на проблему перехода мРНК из неактивного в активное состояние.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международных конференциях: "Translational Control" (Колд Спринг Харбор, США, 1994, 1996), на Российско-Германском симпозиуме "Molecular and Medical Genetics" (Кёльн, Германия, 1995), Французско-Российском симпозиуме "Regulation of Gene Expression" (Новосибирск, 1995) и на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", посвященный описанию функций эукариотических белков, взаимодействующих с мРНК в процессе трансляции, "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы". Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.