Введение к работе
Актуальность темы. Биосинтез ДНК. - один из важнейших процессов, текающих в клетке. Ключевыми ферментами биосинтеза ДНК являются К-полимеразы, которые в составе мультиэнзимных комплексов обеспечивают иость копирования генетического материала в процессе деления клетки и его ранность в остальных фазах клеточного цикла. В биосинтезе ДНК в ариотической клетке участвуют по крайней мере пять ДНК-полимераз; в псах, инфицированных ретровирусами, функционируют также обратные кскриптазы этих вирусов. Очевидно, что для понимания процесса биосинтеза К в клетке необходимо изучить свойства индивидуальных ДНК-полимераз.
Особенностью реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНК-полимеразами, ''* яется то, что в каждом единичном акте включения нуклеотидного остатка в инуклеотидную цепь фермент утилизирует природные субстраты различной уктуры. При этом точность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-имеразами, весьма высока. Все это обусловливает интерес исследователей к имологии синтеза ДНК.
Известно, что ДНК-полимеразы человека значительно отличаются друг от га по структуре, свойствам и специфичности. Еще более значительны личия в субстратной специфичности между ДНК-полимеразами человека и іатньїми транскриптазами ретровирусов. Такие различия могут быть выявлены спользованием модифицированных субстратов реакции синтеза ДНК. Кроме о, селективное ингибирование различных ДНК-полимераз человека является >бходимым этапом в изучении биосинтеза ДНК на клеточном уровне.
Исследования в данном направлении представляют интерес и для решения всладных задач, т. к. ингибиторы вирусных ДНК-полимераз используются для іавления репродукции вирусов.
Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования являлось явление закономерностей связывания и утилизации субстратов различными [К-полимеразами.
В работе были поставлены следующие задачи: исследовать субстратную специфичность различных групп ДНК-полимсри-зующих ферментов;
определить различия между этими группами;
выявить селективные субстратные ингибиторы отдельных ДНК-полимераз; сформулировать принципы дизайна стабильных в крови селективных субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.
Научная новизна работы. Впервые исследована стереоспецифичнос-терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы по отношению к нуклеотидным олигонуклеотидным субстратам. Полученные результаты свидетельствуют, чт терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не связывает специфически образом нуклеиновое основание нуклеотидного субстрата и олигонуклеотидног праймера. Впервые выявлены селективные субстратные ингибиторы этог фермента.
Показано, что модификация одного, двух или даже всех трех фосфатны остатков дсзоксинуклеозид-З'-трифосфата не лишает его субстратной активност по отношению к обратным транскриптэзам ретровирусов, но резко увеличивае стабильность соединения в сыворотке крови человека.
Показано, что уплощение структуры гликона значительно увеличивае сродство дезоксинуклеозид-5'-трифосфата к обратным транскриптазам ретрови русов и репаративной ДНК-полимеразе р человека.
Впервые выявлены селективные субстратные ингибиторы ДНК-полиме разы а человека.
Практическая ценность работы. Полученные данные позволили сформулировать принципы дизайна селективных ингибиторов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы на основе а-энантиомеров модифицированных дезок-синуклеозид-5'-трифосфатов. В перспективе это дает возможность исследовать функцию этого малоизученного фермента в прс-В-лимфоцитах. Создание ингибиторов этого фермента может иметь практическое значение в связи с тем, что его уровень значительно повышен при некоторых острых лейкемиях.
Сформулированы принципы создания стабильных в крови субстратных ингибиторов обратной транскригггазы ВИЧ. Проведенные исследования являются важным этапом в создании препаратов, предотвращающих инфицирование клеток ВИЧ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей в международных журналах и 2 статьи в отечественном журнале.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 11-м Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их практическое применение" (Левен, Бельгия, 1994 г.), и международных конференциях "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1994 г.) и "Молекулярная биология на границе XXI века. Структура генома и функциональный анализ" (Москва, 1994 г.).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяти разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение и Выводы. Работа изложена на 1J.Q. страницах и содержит $.6.. рисунков и .......
таблиц. Список цитируемой литературы включаетг^^работ^г^