Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из значительных событий в биохимии и молекулярной биологии последнего десятилетия стало обнаружение каталитических свойств у полирибонуклеотидов, впоследствии выделенных в отдельный класс каталитически активных молекул рибонуклеиновых кислот и получивших название "рибозимы".
Благодаря небольшим размерам они являются очень удобной моделью как для изучения механизма действия каталитических РНК, так и для их практического применения. Весьма интенсивно, особенно в последние годы, развиваются исследования рибозимов, связанные с использованием их в качестве терапевтических агентов. В частности, как удобные и эффективные инструменты для ингибирования экспрессии генов клеточного и вирусного происхождения, рибозимы открывают путь к созданию новых подходов к терапии вирусных инфекций, опухолевых и наследственных заболеваний. Кроме того, для нужд сельского хозяйства принципиально возможно создание трансгенных растений и животных, стабильно синтезирующих рибозимы строго направленного действия (за счет фланкирующих антисенс-последовательностей) против определенных патогенов. Такие животные и растения будут обладать устойчивостью к определенным инфекциям вирусного или бактериального происхождения. Особую ценность рибозимам как потенциальным терапевтическим агентам придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичность.
По своей биологической активности рибозимы сходны с антиСмысловыми РНК. Однако, использование антисмысловых РНК для ослабления экспрессии генов сильно ограничено из-за стехиометрической природы ингибирования. Созлание
антисмысловых молекул с рибозимной активностью, которые способны не только образовывать комплекс с РНК-мишенью, но и расщеплять в ней определенную фосфодиэфирную связь, позволяет снять это ограничение, поскольку каталитически активные молекулы не расходуются в процессе расщепления.
Дальнейшее применение рибозимов в качестве потенциальных терапевтических агентов будет зависеть от разработки оптимальных способов переноса, эффективности и стабильности экспрессии искусственных генов рибозимов в клетке.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось конструирование и изучение биологических свойств in vitro и in vivo генов рибозимов, направленных на ингибирование вирусных инфекции на примере вируса гриппа А.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
-
Создать искусственные гены функционального и дефектного рибозимов типа "головка молотка", направленные против мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А.
-
Создать генно-инженерные конструкции, содержащие гены рибозимов под контролем различных регуляторных элементов для исследования биологической активности рибозимов в бесклеточной системе и в культуре клеток.
-
Получить дефектные рекомбинантные аденовирусы на основе Ad5 человека, несущие гены рибозимов, направленные против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А. Исследовать экспрессию генов рибозимов и их биологическую активность при инфекции этими рекомбинантными вирусами культуры клеток.
Научная новизна и практическая значимость.
Сконструированы искусственные гены рибозимов, направленные против мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А. Исследована биологическая активность рибозимов в бесклеточной системе. Обнаружена способность функционального рибозима расщеплять модельный субстрат in cis (внутримолекулярно) и in trans (межмолекулярно).
Создана серия генно-инженерных конструкций, содержащих гены рибозимов под контролем промотора цитомегаловируса человека и в составе гена вирус-ассоциированой РНК аденовируса птиц CELO (VA РНК CELO). С использованием этих конструкций получены линии клеток, стабильно экспрессирутацие гены рибозимов; показано ингибирование синтеза вирусных белков и репродукции вируса гриппа А различных штаммов в этих линиях клеток.
Впервые получены дефектные рекомбинантные аденовирусы на основе Ad5 человека, несущие гены функционального и дефектного рибозимов, направленных против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А под контролем промотора цитомегаловируса человека в районе делетированной Е1 области генома. Показана экспрессия функционального и дефектного рибозимов в линии клеток CV-1, инфицированных рекомбинантными аденовирусами, и ингибирование репродукции вируса гриппа А в этой линии клеток.
Работа представляет не только научный, но и, в перспективе, может иметь и практический интерес, так как сконструированные рибозимы могут быть использованы для получения трансгенных животных, устойчивых к вирусу гриппа А. В частности, в свиноводстве, весьма актуальным является вопрос получения трансгенных свиней, устойчивых к вирусу гриппа. Кроме того, рибозимы в составе геномов оекомбинантных аденовирусов могут применяться в дальнейшем
для эффективного ингибирования инфекции вирусов гриппа А сельскохозяйственных животных и птиц.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 151 библиографическую ссылку. Работа изложена на 115 машинописных страницах, включая 4 таблицы и 15 рисунков.