Введение к работе
Актуальность . работы. Agrobacterlim tumsfaclens
почвенный фитопатогек, вызывающи у растения образование
опухоли (корончатого галла) в месте заражения. Механизм
Образования ОПухаЛИ ИЗВеСТеН В ОбЩИХ Чертах IHooykaas and
Schiiperoort, 19921, однако, многое в этом процессе остается пока не внясненннм. Фрагмент Ті-плазмидн агробактеркя -Т-ДНК - переносится при инфекции в клетки растения и интегрируется в ядерный геном. Гены, входящие в состав Т-ДНК, экспрессируются в растительных клетках. Часть генов Т-ДНК кодирует биосинтез фитогормонов - ауксина и цзтокияина, экспрессия зтих генов приводит к образованию опухоли в месте заражения. Кроме того, Т-ДНК долина содержать гены,- продукты которых регулировали Он развитие опухали. Один из таких генов был идентифицирован - ген 5, который регулирует активность ауіссина в клетках опухоли
iKorber et al, 19911. В ПОСЛЄДНИЄ ГОДЫ СТЭЛа ИНТЄНСИВНО
изучаться регуляция активности промоторов генов, входящих в состав Т-ДНК. Было показано, что промоторя генов Т-ДНК способны обеспечивать дифференциальную экспрессии репортерного гена в трансгеннпх растениях органоспеїшфачную и зависимую от стадии развития растения; для некоторых из этих промоторов было показано, что они способны реагировать на поранение растения и фитогормонн (An
et al, 1986, 1990; Langridge et al, 1939; Koncz and Schell, 1986; Korber et al, 1991; Kononowicz et al, 1992; Uattsson et al, 1992; Strabala et al, 1993). ВЫЯВЛеНЫ фУНКЦИОНаЛЬНО
важные элементы зтих промоторов, определяпние их
дифференциальную ЗКСДреССИЮ (Kononowicz et al, 1992; Neuteboom et al, 1993a; Leung et al, 1991; Guevara-Garcia et al, 1993; Ha et al, 1989; Mitra et al, 1990; Kim et al,
1994). Определены белковые факторы, взаимодействующие С
ЭТИМИ tfUC-ЭЛемеНТамИ (Neuteboom et al, 1993b; Lam et al, 19Б9; Singh et al, 1989, 1990; Fromm et al, 1989,- Tokuhisa
et al, 19901. Такие исследования, во-первых, способствуют пониманию механизмов развития и функционирования опухоли. Во-вторых, геныТ-ДНК являются удобной моделып для изучения
механизмов регуляции генов в растениях, поскольку имеют регуляторше области небольшой протяженности.
Ген бъ является одним из немногих генов Т-ДНК, функция которых пока неизвестна. Выяснено только, что экспрессия гена бъ,особым образом модулирует клеточный рост, и функции этого гена связаны с регуляцией активности фитогормонов в
Клетках ОПУХОЛИ (Spanifcr et al, 1989; TinlancL et al. 19B9,
1990, 1992). 5'-регуляторная область гена № никогда ранее на изучалась, мы поставили своей целью изучить регуляторную активность 5' -фланкирующей области гена бь из Ті-плахадн
Во542 (Hood et al, 1984) В ГраНСГеННЫХ растениях. Результаты
исследования регуляции активности гена бь могут быть полезны при изучении роли этого гена в процессе развития корончатого галла.
Цель работи 1. Клонирование и определение нуклеотшшой последовательности 5'-фланкируидей области гена бь из ті-ДНК рТ1Во542. 2. Изучение активности данной регуляторной области в различных органах трансгенных растений и сравнение ее с активностью промотора 35S-e. з. Выяснение влияния поранения растения на активность регуляторной области гена бь. 4. Изученпз влияния фитогормонов на активность регуляторной области гена &ъ.
Научная норизна и практическая ценность работы Впервые клонирована и секвенирована 5'-регуляторная
Область Гена 6Ь ИЗ рТ1Р^542, ЯВЛЯИДЄГОСЯ ОДНИМ ЕЗ НЄШ0ГИХ
генов Т-Д-ІК. функция которого пока неизвестна и регуляция экспрессии которого никогда ранее не анализировалась. Впервые проведен функциональный анализ 5'-регуляторной области гена бь. Показано, что она способна обеспечивать ДЕффорезциальпуш экспрессию как в вегетатквннх, таї; .и в репродуктивных органах трансгенных растений. Проведено сравнение уровней" экспрессии, обеспечпваешх изучаемой областью и промотором 353-е в различных органах трансгенных растений. Изучено влияние фитогормонов на активность 5'-регуляторной области гена бь, впервые показано, что эта активность стимулируется ауксинзън, а такхе в ответ на поранение растения. Полученные данные могут быть полезны при
изучении роли гена 6ь в развитии корончатого гахла. Кроме того, 5'-регуляторная область гена бъ, активность которой нами охарактеризована, монет бнть использована для экспрессии генов в трансгенных растениях.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на і Всесоюзном симпозиуме "Новне методы оиотехнологжи растений", Пущино, 1991; на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993; на 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток растении и биотехнология". Алма-Ата, 1933; на Конференции "Генетическая инггнерия и биотехнология", №шск, 1ЭЭ4; на заседании коллоквиума Центра "Биозняенерия" РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из
.введения; трех глав, выводов и списка литературы. Она
изложена на страницах, содержит рисунков и