Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной биологии является изучение механизма активации пролиферации неделящихся клеток под воздействием специфических и неспецифических факторов. К числу таких факторов, могущих вызвать пролиферацию клеток, в последнее время стали относить излучение He-Ne лазера. Это излучение ислользуют в клинике для лечения трофических язв и долго незаживающих ран. В литературе имеются некоторые сведения о стимулирующем влиянии облучения на ряд клеточных процессов. Наиболее четко такое влияние было продемонстрировано на примере дрожжевых клеток (Федосеева и др., 1986). Имеются данные о стимуляции пролиферативных процессов и некоторых животных клеток. Однако нам не известны работы, в которых было бы детально изучено действие лазерного облучения на неделящиеся клетки, хотя некоторые данные в этом отношении имеются. Так, например, показано, что облучение Не-іг.е лазером оказывает стимулирующее действие на ряд иммунологических свойств лимфоцитов (Гамалея и др., 1983, Трапезников и др., 1984). В то же время стимуляции пролиферации этих клеток под воздействием лазерного облучения обнаружено не было (Meyers et al., 1987).
Малые лимфоциты периферической крови здорового взрослого человека являются классической моделью неделящихся клеток. На их долю приходятся 90# от всех содержащихся в крови человека лимфоцитов (Елисеев, 1983). При стимуляции их определенными ми-тогенами (например, фитогемагглютишшом) наблюдается выход большей части популяции из стадии покоя, продвижение по циклу, вступление в фазу синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты и митоз.
Представлялось' интересным изучить изменение свойств облученных лимфоцитов с помощью комплекса методов, используемых при исследовании свойств активированного хроматина, и сравнить с результатами, полученными при стимуляции лимфоцитов фитогемаг-глютинином.
Цель и задачи работы.
Во-первых, исследовать связывание хроматина облученных лимфоцитов с низкомолекулярным лигавдом - акридиновым оранжевым, а также подробно изучить кинетику связывания этого лиганда в течение шести часов после воздействия.
Во-вторых, изучить матричную активность хроматина клеток
-2-по включению меченого предшественника рибонуклеиновой кислоты -14С-уридина - в течение первых 12 часов после облучения.
В-третьих, посмотреть, изменяется ли содержание свободного внутриклеточного кальция в первые минуты после облучения, так как в этот период наблюдается резкий подъем в. содержании этого иона под воздействием митогена ( Komada, I9S9).
В-четвертых, детально изучить в течение длительного промежутка времени (одной недели) уровень включения за каждые сутки меченого предшественника дезоксирибонуклеиновой кислоты - тимиди-на-в облученные лимфоциты.
В-пятых, определить чувствительность облученных лимфоцитов к интерлеЙкину-2, являющемуся фактором роста активированных Т-лимфоцитов.
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые подробно были исследованы некоторые свойства хроматина облученных- лимфоцитов на протяжении нескольких дней.
Было показано, что облучение Не-Не лазером вызывает усиление связывания хроматина с акридиновым оранжевым в интервале доз 28-112 Дж/м^ с максимальным эффектом при дозе 56 Дж/м? Поэтому с помощью теста на связывание хроматина с АО можно определить оптимальную дозу облучения суспензии лимфоцитов ( ід vitro). Найденная таким способом оптимальная доза облучения Д=56 Дж/ьг способна вызвать в лимфоцитах события, аналогичные тем, которые происходят в процессе активации лимфоцитов при действии на них фитогемагглгатинина. К ним относится кратковременное повышение концентрации свободного внутриклеточного кальция в первые минуты после облучения, а также кинетики связывания акридинового оранжевого с хроматином в течение первых 6 часов и включения "*С-ури-дана. Однако в более поздние часы установлены отличия в свойствах хроматина облученных и митоген/стимулированных лимфоцитов. Во-первых, у облученных лимфоцитов к 12 часам нет резкого подъема включения чЗ-уридина, характерного для митоген/стимулированных клеток. Во-вторых, отсутствие синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты наблюдалось только в облученных клетках. В-третьих, чувствительность облученных клеток к интерлейнину-2 не отличалась от интактннх лимфоцитов. Показано потенциирущее действие облучения на бласттрасформацию лимфоцитов, вызванную фитогемагглютини-ном. Кроме того-, свойство излучения Не-де лазера позволяет пред-. ложить объяснение механизма лечебното эффекта этого излучения
- З -
Не-дае лазера. Результата работы могут послужить основой для разработки методов подбора доз облучения при лазерной терапии.
Аптобащщ работы. Материалы диссертации были представлены на ІУ Всесоюзной школе "Применение лазеров в биологии" (Кишинев, 1986г.'); на 2-ом Европейском фотобиологическом конгрессе (Падуя, 1987г.); на Всесоюзной конференции "Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь" (Киев, 1989г.); на 9-ом Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине" (Тарту, 1990 г.); на семинаре Отдела анатомии Медищнской школы штата Луизиана, Новый Орлеан (США., 1991 г.).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и описка цитируемой литературы. В списке литературы ІСІ наименований, из них PjL иностранных источника. Работа содержит {Оо страниц, включая 8- рисунков и 7 таблиц.