Введение к работе
Актуальность темы. Изучение механизма биосинтеза белка является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Для детального понимания механизма работы белоксинтезирующего аппарата клетки необходимо знание структурной организации его компонентов. Центральная роль в биосинтезе белка отведена рибосоме. Наиболее изученными являются бактериальные рибосомы и, в первую очередь, рибосомы из Escherichia coli. Все белки из рибосом E.coli (их свыше 50) были выделены и охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов, определены их первичные структуры. Однако попытки кристаллизации рибосомных белков из E.coli и исследования структуры этих белков методами ЯМР-спектроскопии натолкнулись на серьезные трудности. С восьмидесятых годов начались исследования рибосомных белков из двух других микроорганизмов - термофильных эубактерий: Bacillus xtearolhermophilu\ и Thermus thcrmophilus, белки из которых более стабильны и поэтому более перспективны для структурных исследований. В группе структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН ведется работа по кристаллизации и структурным исследованиям белков из T.thcrmophilus. Все рибосомные белки из этого микроорганизма были выделены и охарактеризованы. Белки S6, S8 и L1 были закристаллизованы и их прос г ране і пенные структуры были определены. Клонирование и секвенирование генов рибосомных белков из T.thcrmophilus и получение суперпродуцентов ттнх белков открыло в последние юлы новые возможности для структурных исследований. Недавно были определены <ристаллографические структуры белков 1.22 и L30. Ведутся также исследования структуры іяда белков в растворе методами ЯМІ'-спектроскоіши.
Настоящая работа является частью комплексных исследований структуры эибосомных белков из T.lhcrmophilns и направлена па определение первичной структуры іяда белков путем клонирования и секвенирования соответствующих генов, получение нтаммов-суперпродуцептов, разработку процедур выделения белков, продуцированных в слетках E.coli, кристаллизацию этих белков и их структурные исследования мегодачи >ентгеновской кристаллографии и ЯМІ'-спектроскопии
Цель работы - иіучение сіруктурьі рибосомных белков из r.lhcrmoplulus
Основные задачи работы: клонирование генов белков L35 и S16, определение іуклеотидной последовагелі.мости генов rpsl6, грі4. грІ29 н rpl35, получение ішаммоп-уиерпродуцентов для белкой SIO, S14, 1.4, 1.5. L29, L35, поиск условий крисіаддішцни
"чков SI5 и L4, подбор и оптимизация условий для исследования структуры белков S15 и S19 в растворе.
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонированы гены рибосомных белков L35 и SI6 из T.lhermophiius, определена нуклеотидная последовательность генов rps!6, rpI4, rpl29 и rpI35, кодирующих белки S16, L4, L29 и L35 соответственно Получены штаммы-суперпродуценты для белков S10, S14, L4, L5, L29, L35, оптимизированы условия суперпродукции этих белков. Разработаны процедуры выделения белков из суперпродуцентов. Найдены условия кристаллизации белка S15 и проведены поиски условий кристаллизации для белка L4. Оптимизированы условия для исследования структуры белков S15 и S19 в растворе методами ЯМР-спектроскопии. Получены предварительные ЯМР-спектры для белков S10, S14, S15, S16, S18, S19, L4, L23, L29, свидетельствующие о том, чго структуры белков S15, S16, S18, S19 и \А могут быть исследованы в растворе. Выделены в препаративных количествах изотонически меченые белки S15, S19 и L4 для определения структуры этих белков в растворе. При непосредственном участии автора определена структура рибосомного белка S15 в растворе. Оказалось, что в составе белка S15 отсутствует р-структура и он является полностью а-спиральным РНК-связывающим белком. Оказалось также, что тип укладки молекулы белка S15 уникален, структурная гомология не обнаружена ни с одним из известных белков. Показана возможность определения в растворе структуры белка S15 в комплексе со специфичным фрагментом 16S рРНК. Методические разработки по приготовлению белковых образцов для структурных исследований методами ЯМР-спектроскопии представляют практический интерес для специалистов, работающих в данной области.
Структура диссертации: Диссертация состоит из трех частей: 1) обзор литературы,
2) экспериментальная часть, 3) результаты и их обсуждение. Работа завершается выводами и
списком цитируемой литературы (253 ссылка). Работу иллюстрирует рисунка и
таблиц. Общий объем диссергации 1^0 страниц.
Апробация работы и публикации. Результаты диссертации докладывались на Шестой Международной конференции но кристаллизации биологических макромолекул (Хиросима, Япония, 1995), на Международной конференции по структурам и функциям рибосом ( Виктория, Канада, 1995), на Международной конференции "Термофиллы-96" (Атенс, США, 1996), на Семнадцатой Международной конференции "Магнитный резонанс в биологических системах" (Кейстон, США, 1996), на Международной конференции исследователей из стран Балтии, центральной Европы и бывшего Советского Союза (Прага,
(Талберг, Швеция, 1997), на Международной конференции "Узнавание биологических молекул" (Спецес, Греция, 1997), на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994, 1995, 1996, 1997). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. В банк аминокислотных последовательностей белков помещены первичные структуры белков S16, L4, L29 и L35.
Обзор литературы посвящен методам оптимизации условий экспрессии генов рекомбинантных белков в бактериальных клетках, проблемам связанным с образованием телец включения и с выделением и ренатурацией белков из телец включения.