Введение к работе
&кдадшоиъ_яд^демьи Ген wac (whiskers antigen control) бактериофага T4 кодирует фиоритин, который является удобной моделью для изучения фолдинга и сборки ct-спирапьных белков типа coiled-coil (Месянжинов, 1997).
Фибритин формирует комплекс "воротиичек-бакенбарды" (Coombs, Bserling, 1977; Николаева и соавт., 1987), который необходим для сборки и присоединения длинных хвостовых фибрилл к частице фага (Terzaghi et а!., 1979; Wood, Conley, 1979) и участвует в регуляции адсорбции вируса на бактериальных клетках (Conley, Wood, 1975). Нуклеотидная последовательность гена wac фага Т4, кодирующего белок, состоящий из 487 аминокислотных остатков, впервые определена 8 лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского А.Г. Прияиповым и др. (Prilipov et а!.. 1988). При анализе аминокислотной последовательности фибритина (Sobolev, Wesyanzhinov, 1991) была выявлена периодичность распределения гидрофобных остатков, характерная для суперспиральных белков. Однако, а-спиральный coiled-coil разделен на 12 сегментов участками, лишенными гептадной периодичности и сходными с петлями глобулярных белшз. Б.П. Ефимов и соавторы (Efimov et al.,1994) доказали, что фибритин - тример длиной 53 нм с параллельной уюїздкой цепей, N-концевой домен молекулы фибритина, состоящий из 47 аминокислотных остатков, отвечает за связывание с частицей бактериофага и, очевидно, участвует в формировании "воротничка", в то время, как С-концееой домен, состоящий из 29 аминокислотных остатков, находится на дистапьном конце молекулы.
Цель и зааачи работы. В работе изучены механизмы фолдинга и тримеризации фибритина м уточнена его структурная организация.
Экспериментальная часть работы посзящека решению следующих задач;
1). Определению нуклеотидчой последовательности генов wac, кодирующих фибритины бактериофагов 12, 0x2 и КЗ, родственных Т4.
2). Созданию делеционных мутантов фибритина бактериофага Т4, пригодных для кристаллизации и последующего ренттеноструктурного анализа.
3). Поиску участков з последовательности фибритина, функции которых связаны с инициацией фолдинга и тримеризации.
4). Получению мутантов фибритина с аминокислотными заменами в области его С-конца, нарушающими фолдинг белка.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые определены нуклеотидные последовательности генов wac фагов Т2, 0x2, КЗ. Создана серия плазмидных векторов для экспрессии делеционных мутантов фибритина различной длины. Получены в препаративных количествах делеционные мутанты - белки Fbr-M и Fbr-E имеющие небольшой размер - 90 и 120 аминокислотных остатков в полипептидной цепи и массу мономера 3,2 кДа и 12,2 кДа, соответственно, пригодные для рзнггеноструктурного анализа и определения пространственной структуры белка. Доказано, что последовательность С-концевого домена фибритина отвечает за инициацию его тримеризации. Установлена роль ароматических остатков С-концзвого домена в сборке белка в тример. Получены точечные мутанты фибритина с аминокислотными заменами в С-концевом доглене.
ііошшньшлдяаж^иа^іьшимьіаііа .защиту.
1. Нуклеотидные последовательности генов war. и аминокислотные
последовательное кодируемых фибритинов бактериофагов Т4, Т2, 0x2 и КЗ
имеот высокую степень гомологии.
-
Получена серия далециинных вариантов фибритина фага Т-4. пригодных для кристаллографических исследований,
-
Доказзна роль С концевого дсмена фибритина а инициации тримеризации ere молекулы
Диссертация состоит /э зьеденил, обзора научной литературы по теме диссертационной работы, методи-;аскэй части, результатов исследования и их обсуждения зыаодов и списса цитируемой литературы. Объем диссертационной робоп* составляет 1 іО страну машинописного текста. Диссертация содержит !6 рисунков и 4 таблицы.
Материалы диссертации были лолохень: па X Evergreen Internationa! Т4 Meeting (Олимпия, США, 199;}, XI Evergreen htomanona! Т4 Meeting (Олимпия. США, 1996). Meet і пс о! iiileroationa! Research Scholars from the Baltics. Centra: Europe, and the Former Soviet Union (Прага. 19961, 2-го Биохимического Сьезда (Москва, 13S7).
Материалы диссеріацич изложат* п 3 научных огагвя* и в 3 тезисах конференций. Иукле.о*иднь-!(; последовательное {'л ДНК гена wac бактериофагов Т2. Ох? и К? депонированы в EM8L GDJEBANK.
Щтзмм-* (><№'*№$ ' ЬарПергцфагов. Штамм Escherichia col: Ве/1 исппльзсЕзли дон бырыиива-мя бактериофагов Для получения ллазмидной ДНК использовали опьмм гаш'JM10S.
В работе были и< пользованы бактериофаг^, выделенные ьанее другими
исследователями (в скобках указано! время и і^есто выделения): Т2 (St.Louis
США, 1925;, Т4 (Brooklyn. США, 1944); 0/.2 (Oxford. Великобритания.
1962); КЗ (StockKxru. Швеция. 1949).
КищщщкЩйНуй., гілаі^ид^иі_йежгйшг проводили по стандартным методикам (Sambrook si al.. 1989) Клонирование гена wac бактериофагов Т2. 0x2, КЗ и его фрагментов, пелу^енны/, поладиеразной цепной реакцией, производили ь сектора p3M-3z. pGM-5zf+, pGM-~zt-*- (Рготеда.США;. Зкспрессионныь ллазмиДої ныли созданы ни основи захторов pTZ-'ЭР (Pharmacia, Швеция), рЕТ-1?Ь (Novagerse, США/, содержащих промотор фага Т7.
Пй0іііа2!2а2ІГІі?А _ ЦЄХІгЙг.-UaSiUiliL АмЛЛИфИКаЦНП фраГМЗНТОВ ДНК
производили методом полммераэ.ной цепной реакции (ПЦР) с использованием звтоглзтическаго амплифихгторз Techno Programmable Dn-Block PHC-1 (Techie LTD, Великобритания). Проводили 20-25 циклов амплификации Для амплификации использовали Taq-полимеразу (Promega, США).
Зкспвессию—мутантных вариантов фибритинз, клонированных в плазмидах под промотором фага Т7, проводили в штамме E.coli BL21(DE3) (Studior et al.. 1990), в хромосоме которого содержится ген РНК-полимеразы фага Т7 под контролем индуцируемого ИПТҐ промотора Lac UV5.
Секвенироаание ДНК. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по методу терминирующего ингибнрования {Sanger. 1977). Для выполнения сиквенсных реакций использовали набор Т7 Seqencing Kit (Pharmacia LKB, Швеция). Электрофоретическое разделение цепей ДНК, получаемых в полимеразнсй реакции проводили на приборе "Macrophor" ("Pharmacia". Швеция).
ад2іра4>2иеа белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Laemmly (Laemmly, 1970) и в системе с трицмиовым буфеоом (Schagger , von Jagoww, 1987).