Введение к работе
Актуальность темы. Исследования в области пиридоксалевого катализа, долгие годы проводившиеся под руководством академика А.Е. Браунштейна, сохраняют свое значение как для теоретической этимологии, так и для прикладной науки. Глутаматдекарбокснлаза (L-глутамат 1-карбокси-лиаза, КФ 4.1.1.15) является пиридоксалевым ферментом и катализирует превращение глутаминовой кислоты в у-аминомасляную кислоту и углекислый газ. Этот фермент играет важную физиологическую роль в организме животных и человека: он обеспечішает процессы возбуждения и торможения в центральной нервной системе, а также является аутоантигеном для аутоантител инсулин-зависимого диабета. Возможность направленного регулирования активности глутаматдекарбоксилазы животного происхождения вызвала многочисленные работы по поиску субстратов и ингибиторов фермента. Наряду с этими работами аналогичные исследования проводятся и с бактериальной ферментом, который доступен для работы в большом количестве и является удобной моделью для изучения общего механизма действия глутаматдекарбоксилазы, полученной из разных источников.
В предыдущие годы были проведены разносторонние исследования глутаматдекарбоксилазы из Е. coli. Изучена обратимая диссоциация гексамера глутаматдекарбоксилазы на неактивные димеры, роль коферыента, рН и сульфгндрнльных групп в формировании макромолекулы фермента. Выявлена роль аргининоаых и гистидиновых остгтков в ферментативной реакции. На основе спектрокинетических данных была предложена схема последовательных стадий ферментативного декарбоксилирования, включающая как основную реакцию, так и побочную - трансаминирование кофермента. В результате исследования большой группы аналогов субстрата выявлены закономерности субстратной специфичности фермента. Получены кристаллы глутаматдекарбоксилазы и проведены предварительные рентгеноструктурные исследования.
Дальнейшая работа, связанная с рентгеноструктурными исследованиями промежуточных фермент-субстратных комплексов при большом разрешении, требует создания современной экспериментальной базы и прежде всего штамма-суперпродуцента. позволяющего получать достаточное количество фермента. Одниц из путей для расшифровки механизиа действия ферментов на уровне трехмерной структуры является исследование комплексов фермента с медленно
превращающимися субстратами; выявление последних и явилось предметом настоящей работы.
Цель данной работы - выделение рскомбинантной бактериальной глутаматдекарбоксилазы, поиск субстратов с низкой скоростью превращения и ингибиторов, способных образовывать необратимые комплексы.
Основные задачи исследования: Разработка условий для выращивания суперпродуцента и выделения гомогенной глутаматдекарбоксилазы из E.coli. Исследование при помощи оптических и кинетических методов природы реакций, происходящих при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы с аналогами субстрата, замещенными по С-3 и С-4 атомам.
Научная новизна и практическая ценность работы: Разработаны условия для
выращивания рекомбинантного штамма-суперпродуцента E.coli
BL2i(DE3)[pGEMEXl/GAD], дающие оптимальный выход бактериального материала и ферментативной активности. Предложена процедура выделения глутаматдекарбоксилазы с высоким выходом гомогенного препарата при помощи ионообменной хроматографии на DEAE Сефарозе CL-6B.
Установлено, что аналоги аспартата - 3-арсоноаланин и 3-фосфоноаланин, а также аналоги глутамата - 2-амино-4-арсономасляьая кислота, 2-амино-4-фосфономасляная кислота, 4-(метилтио)-Ь-глутаминовая кислота и её эритро-диастереоизомер являются медленно превращающимися субстратами и слабыми ингибиторами фермента. Показано, что декарбоксилирование этих соединений сопровождается побочной реакцией - трансаминированием кофермента. Обнаружено, что 3-арсоноаланин и аспарагиновая кислота кроме того связывались с ферментом, образуя необратимый комплекс.
Результаты работы могут быть использованы для развертывания работы по рентгеноструктурным исследованиям фермент-субстратных комплексов и направленному мутагенезу глутаматдекарбоксилазы.
Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на годичной научной конференции ИМБ РАН (Москва, 1994г) и 9-ом Международном симпозиуме: " Витамин Be и карбонильный катализ " ( Капри, Италия, 1994 г.)
Публикации. По теме диссертации опубликована одна статья и одна сдана в печать.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения.
Работа завершается выводами и списком литературы ( ссылка). Работу
иллюстрируют /а рисунков и <г таблиц. Общий обьем диссертации страниц.