Введение к работе
Актуальность темы. Исследование механизмов действия и специфичности рибонуклеаз представляет большой научный и практический интерес. Эти фермента широко используются при структурно-функциональных исследованиях различных форм РШ, в препаративной биохимии, в генной инженерии. В клетках РНКазы участвует как в процессах деполимеризации РИК, так и в процессах трансформации генных транскриптов до функционально зрелых компонентов трансляционной системы. В широко проводящихся исследованиях РНК-деполи-меризуицих ферментов до последнего времени основное значение уделялось пиримидин- и гуанозинспецифичным РНКазам. Эти ферменты расщепляют межнуклеотидные связи РНК в области локализации соответствующих нуклеозидов в 10—10" раз быстрее, чем остальные связи. Кроме того известна группа неспецифических РНКаэ, расщепляющих все межнуклеотидные связи РНК примерно с одинаковой скоростью. Недавно обнаружена немногочисленная группа РНКаэ, проявляющая сравнительно невысокую специфичность к пуриновим нуклео-тидам при расщеплении РНК. Эти рибонуклеазы представляют большой интерес для изучения общих структурно-функциональных взаимоотношений между ферментом и субстратом, определяющих специфичность действия РНК-деполимераэ. Однако, до настоящей работы ни для одной из'РНКаэ с указанным выше типом специфичности не имелось количественных характеристик осуществляемых ими реакций.
Цель и задачи работы. В связи со систематическими исследованиями РНКаз, проводимых в течение многих лет в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР, была поставлена задача количественно исследовать специфичность действия одной из таких РНКаэ, а именно РИКагеиз споровых бактерий B.lntermedluB 7Р.
С этой целью предполагалось провести изучение параметров реакции гидролиза РНКазой B.lntenaedius 7Р в ряду мононуклео-зид-2',3'-циклофосфатов, динуклеозидфосфатов и синтетических гомополинуклеотидов.
Одновременно ставилась задача разработки и получения кристаллов РНКазы, пригодных для рентгеноструктурного анализа.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые были получены кристаллы бактериальной РНКазы B.lntemediue 7р и ее комплекс с ингибитором. Впервые было установлено, что РНКаза В.Intermedius 7J при гидролизе нукяеоаид -г'.З'-циклофосфатов и динуклеозидмонофосфатов проявляет себя как гуанозинспецифичный фермент, а при переходе к полинуклеотидным субстратам она является пуринпредпочитавщим ферментом. Впервые было показано, что изменение специфичности РНКазы B.livtermedlue 7Р не мояет быть объяснено только влиянием природы основания нуклеотида и» 05»-конце р&сцепляеуой фосфодиэфирной связи. Было установлено, что реакция гидролиза низкодалекулярных и полинук-леотидных субстратов осуществляется в одном и том ке активном центре рибонуклеази. Выла предложена гипотеза, описывающая, каким образои взаимодействие зарядов фосфатных групп полинуклео-тядного субстрата с зарядами на поверхности молекулы фермента может модулировать специфичность действия РНК&зы В.Intermedins 7Р. Эта гипотеза нашла структурное подтверждение при рентгено-СТруктурных исследованиях комплекса РНКазы B.lntenaedius 7
Практическая ценность работы. РИКаэ B.Intermediue 7р является отечественным препаратом, получаемым в настоящее время путем крупномаевтабного выделения на Экспериментальном заводе Института органического синтеза АН Латвийской СССР. В данной
работа получена кинетические характеристики фермента, которые широко используются в медицинских исследованиях, препаративной биохимии и генной инженерии. Нами предложено и апробировано использование препаратов фермента в качестве ингибитора фитови-русов и вироидов, на что получены авторские свидетельства,
Адробашя работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по двустороннему севетско-итальянско-му сотрудничеству "Макромолекули в фушашонирупцеЯ клетке" .Пу-щино, 1980 г., ІУ Всесоюзном симпозиуме "Физико-химические основы ферментативного катализа и его регуляция", Москва, 1982 г., 37 Международном симпозиуме "Метаболизм и энзимология нуклеиновых кислот", Братислава, 1982 г., совещаниях координационного совета межвузовской межотраслевой целевой программы работ по решению научно-технической проблемы "Цклэаэы мшрооргежзирв и их практическое использование", Казань, 1984 г., У Международном симпозиуме "Метаболизм и энзимология нуклеиновых кислот", Братислава, 1984 г., годичных конференциях научночлсоледователь-ских работ Института молекулярной биология им. В.А. Энгельгард-та АН СССР.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов п методов исследования, обсуждения результатов п выводов, а также списка цитируемой литературы.