Введение к работе
Актуальность темы. Изучение механизмов Т-клеточного распознавания антигенов является одной из наиболее важных проблем иммунологии в связи с ключевой ролью Т лимфоцитов в индукции и регуляции нормальных и патологических иммунных реакций. В результате развития молекулярно-генетических, иммунохимических и клеточных подходов к изучению распознавания антигенов (АГ) Ви Т лимфоцитами (Вл и Тл) были выявлены коренные различия функциональных характеристик иммуноглобулиновых (Ig) рецепторов Вл и Т-клеточных рецепторов (ТкР) (Брондз, 19S7. Berzofsky et al, 1987, 1988, Chlen, Davis, 1993). Было показано, что, в отличие от Ig-рецепторов Вл, распознающих антигенные детерминанты на поверхности нативной молекулы АГ, рецепторы Тл распознают АГ в форме короткого пептидного фрагмента, связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или П.
Интенсивные исследования закономерностей формирования тримолекулярного комплекса МНС молекула/пептид/ТкР стали проводиться лишь в последние годы. Были обнаружены существенные различия между пептидами, презентируемыми в контексте молекул МНС класса I и II, а также между путями и механизмами процес-сирования и презентации АГ в контексте молекул МНС класса I и II (Matsumura et al, 1992, Monaco, 1992, Neefjes, Ploegh. 1992, Stern et al, 1994). К настоящему времени более подробно исследованы молекулярные механизмы взаимодействия пептидов с молекулами МНС класса I. Особенности презентации пептидов в контексте молекул МНС класса II стали исследоваться лишь недавно и остаются в настоящее время менее изученными.
Исследования Т-клеточного распознавания АГ пептидов, в контексте молекул МНС класса II проводились в основном с использованием экзогенных АГ. Однако в настоящее время показана способность молекул МНС класса II презентировать пептиды, происходящие из эндогенно-синтезированных молекул. Среди таких пептидов значительную часть составляют пептиды молекул Ig, молекул МНС, инвариантной цепи (И).
Эти пептиды могут играть существенную роль в формировании Т-клеточного репертуара, участвуя в позитивной и. негативной селекции' незрелых Тл в тимусе, а также в регуляции иммунного ответа. Однако механизмы процессирования и презентации таких
пептидов в контексте молекул МНС класса II остаются окончательно не изученными.
В связи с вышеизложенным представляет несомненный интерес исследование структурных закономерностей взаимодействия Ig-пептидов с молекулами МНС класса II. а также изучение особенностей распознавания комплекса Ig-пептид/МНС II Т клетками.
В качестве маркеров Ig-молекул, способных распознаваться Т клетками, могут выступать аллотипические детерминанты. Существование аллотипических вариантов легких цепей Ig крыс дало возможность создания уникальной системы для изучения роли Ig-пептидов в формировании Т-клеточного ответа (Yurin et al, 1989, Rudensky, Yurin 1989).
Igk-1 локус крыс определяет две аллельные формы к цепей Ig - Igk-la и Igk-lb, которые отличаются 11-ю аминокислотными остатками константного района. Инбредные линии характеризуются экспрессией первого или второго варианта аллотипических детерминант, представленных на 95 сывороточных и мембранных Ig.
Предварительные данные, полученные в нашей лаборатории, показали, что иммунодоминантная Т-клеточная детерминанта расположена во фрагменте Ск 176-214, содержащем три аллотипические замены в 184. 185 и 188 положениях (Yurin et al 1989).
Один из возможных путей дальнейшего исследования распознавания аллотипической детерминанты Ig заключается в использовании синтетических пептидов (СП), перекрывающих отдельные фрагменты, характерные для различных аллотипов. Этот подход был применен в настоящей работе.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование структурных основ Т-клеточного распознавания аллотипической Igk-lb детерминанты Ig в контексте молекул МНС класса II, а также изучение роли Ig-пептидов в формировании Т-клеточного антиаллотипического ответа у крыс.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
точная локализация иммунодоминантной Igk-lb детерминанты, распознаваемой специфичными Тл;
исследование особенностей формирования Т-клеточного ответа на различные Ig-пептиды у крыс, конгенных по Igk-1 локусу;
получение и характеристика клонов Тл (кТл). специфичных к синтетическому пептиду СП. lb, содержащему Igk-lb Т-клеточную
детерминанту;
определение минимальной длины аллопептида, необходимой для эффективной презентации его молекулами МНС класса II и распознавания специфическими кТл;
исследование роли отдельных ак остатков в формировании функциональных субобластей Igk-lb детерминанты - агретопа и эпитопа, обеспечивающих взаимодействие ее соответственно с молекулами МНС класса II и индивидуальными ТкР специфичных клонов.
Научная новизна. В настоящей работе впервые описаны структурные основы презентации АГ пептидов молекулами МНС класса II крыс на модели аллотипической Igk-lb детерминанты. Впервые исследована тонкая специфичность распознавания Ig-nen-тида значительной панелью крысиных кТл, что поззолило выявить большое разнообразие Т-клеточного ответа на короткий пептидный АГ. Среди исследованных СП. lb-специфичных кТл, различающихся по тонкой специфичности индивидуальных ТкР, выявлено два типа реактивности, которые соотнесены с двумя различными субобластями распознавания СП.lb. Установлена минимальная длина аллопептида, необходимая для распознавания его специфическими кТл в контексте молекул МНС класса II. Впервые показано, что заряженные ак остатки пептида могут оказывать негативный эффект на распознавание комплекса пептид/МНС рецепторами Т клеток. Получены данные, показывающие, что селекция Т клонов, специфичных к аллотипической детерминанте Ig, зависит от способности Igk-lb-пептидов эффективно взаимодействовать с рестриктирующи-ми молекулами МНС класса II.
Практическая ценность работы. Практическая значимость работы заключается в том, что использованная система пролифера-тивного ответа Тл на Ig-пептиды может служить моделью для исследования аутоиммунных процессов. Полученные данные могут внести ощутимый вклад в разработку современной стратегии получения вакцин на основе АГ пептидов. Результаты, представленные в работе могут также быть использованы в создании научных рекомендаций по разработке перспективных методов иммунотерапии (пептидная терапия) при аутоиммунных заболеваниях и опухолевых процессах.
Апробация результатов и публикации. Апробация диссертации состоялась на семинаре секции биоинженерии белков и нуклеино-
- 4 -вых кислот ТосНИИгенетика". Результаты работы были представлены на 10-м конгрессе Европейской федерации иммунологических обществ (Эдинбург. 1990). на конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, 1993), на международном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Кейстоун, 1994), на III научной конференции ГосНШгенетика (июнь, 1995). Основные материалы диссертации изложены в 8 печатных работах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав изложения собственных результатов и их.обсуждения, заключения,, выводов и списка литературы из 186 наименований отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 215 страницах, включая 26 рисунков и 7 таблиц.