Введение к работе
Актуальность работы, гормоны роста (ГР) представляют собой полнпептндные гормоны с молекулярной массой 22 кд, состоящие из одной цепи, они синтезируются о передней доле гипофиза н необходимы как для нормального роста и развития организма, так и для регуляции ряда анаболических процессов. Характерными особенностями ГР, в этличие от других гормонов белковой природы, являются выраженная зндоспецифичность и множественность биологических активностей.
Механизм действия ГР на молекулярном уровне остается «достаточно изученный. Известно, что основной тканью-миоеныо кенствня ГР является печень, где гормон запускает синтез інсуликоподобного фактора роста Г (соматомедіїна). В клетках печени, і также других тканей обнаружены мембранные рецепторы ГР. Очевидно, (то важным направлением исследований механизмов действия ГР [Вляется детальная характеристика рецепторов к ходнруших их-генов, [ервые успехи в этой области были свяэанч с клонированием кднк іецепторов ГР из печени кролика и человека. определение уклеотидных последовательностей кдпк показало, что рецепторы ГР релставляит собой белки, состояние из приблизительно 600 минокнслотных остатков. Они содержат внеклеточный гормон-вяэываюаий участок, короткий трансмембранный домен и нутрнклеточный домен. Позднее, уже в ходе выполнения данной аботы, было сообщено о клонировании фрагментов хромосомного гена ецептора ГР человека и пок:п;шо, что дефекты этого гена приводят к ' дной из фора карликовости, так называемой карликовости ларона [iron-dwarfism). Ген рецептора ГР картирован в хромосоме 5 еловека и занимает участок размером более 87 тыс.п.п.. Кодирующая Эласть гена состоит из 9 акзоиов. Белковыми продуктами гена аляются мембранная форма рецепторі и сывороточный белок, зязывпюинй ГР (СБСГР), который" лишен трансмембранного и іутриклеточного доменов и образуется в результате альтернативного їлаїїсннга пре-мРНК или протеолнтнческого расщепления мембранной )рмы рецептора.
К моменту начала нгшей работы имелись также косвенные данные о ІЗМОКН0Й сложной организации 5'-концевой области генов рецептороз >. Leung et al. (1987) выявили гетерогенность $'-нетранслнруемых іластей (5'-іГТО) кдпк рецепторов ГР человека и'кролика к высказали (ЄАПОЛОКЄНИЄ о существовании множественных экзоноп з лИлерноЛ 5'-0 соответствует!!*- генов, такоэ' строение S'-области гена едполагает наличие альтернативных промоторов и возможность тонкой
регуляции экспрессии гена как на уровне инициации транскрипции, так и на посттранскрипцнонных уровнях.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось более подробное изучение особенностей организации 3'-коицевой области генов рецепторов ГР и экспрессии различных фори мРНК. отличающихся 5'-НТО, в печени крысы и человека, а также поиск альтернативных фори мРНК в других тканях человека. В ходе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи: 1. разработка варианта метода опосредованной лигированиеи однонаправленной полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего избирательно амплифнцировать фрагменты кднк, соответствующие 5'-НТО специфических мРНК. 2. Избирательная амплификация с помощью данного метода и клонирование последовательностей 5'-НТО кДНК рецепторов ГР из печени крысы и человека. 3. Определение куклеотидных последовательностей альтернативных форм ыРНК рецепторов ГР. и их сравнительный анализ. 4. Поиск альтернативных 5'-нетранслируемых последовательностей в мРНК рецепторов ГР различных тканей человека и предварительная оценки их относительного содержания. 5. Предварительная характеристика і'-области хромосомного гена рецептора ГР человека. 6. Клонирование колирующих участков кднк рецепторов ГР и пролактина крысы и ннсулиноподооного фактора роста I крысы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонированы 2 нзоформы кднк рецептора ГР из печени крысы и 8 изофори кДНК рецептор;! ГР из печени человека, отличающихся 5'-НТО. Получены предварительные данные о соотношении представленности этих иэоформ в печени, для нескольких вариантов 5'-НТО мРНК рецептора ГР человека получены данные о ткннеспецифнчности их экспрессии, на основе анализа нуклеотидных последовательностей обнаруженных вариантов 5'-НТО рецептора ГР сделано предположение о возможности модуляции экспрессии этого белка на уровне, инициации трансляции. Обосновано представление о сложности транскрипционных единиц генов рецептора соматптропина. Клонированы транслируемые области КДНК рецепторов ГР и пролактина и участок кднк инсулинополобного фактора роста I (IGF і), кодирующий зрелый фактор из печени крысы. Разработала и успешно применена модификация метода однонаправленной опосредованной лнгированием пцр для обнаружения и изучения вариабельности 5'-концевого участка молекул мРНК (КДНК).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X И XI советско-французских симпозиумах "Организация н экспрессия генома эукариот и прокариот-, г. киев, 1990 и Concarneau. Франция,
1992; на международной симпозиуме 'Synthetic Oligonucleotides: Problems and Frontiers of Practical Application", г. Москва, 1991; на Soveit-oerman/wfcst-Buropean Molecular Biology Meeting, Konstanz, 1991; на конференции по геному человека (США-Россия), г. Санкт-Петербург, 1992; на семинаре отдела генетической инженерии ИМБ РАН, г. Москва, 1992.
Структура и объем диссертации. диссертация состоит иэ введения, трех глав, выводов и списка литературы, она изложена на 106 страницах, содержит У2 рисунка и библиографический список иэ 77 названий.