Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время важнейшей задачей в исследовании кроветворения является выяснение молекулярных механизмов контроля гематопоэза. Поддержание и координация пролиферации и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток обеспечивается широким спектром межклеточных взаимодействий, в которых значительную роль играют как мембрано — связанные, так и свободные колонне — стимулирующие факторы и цитокины. В этой связи представляет большой интерес изучение рецепторов этих факторов, а также связанных с ними молекулярных систем модуляции сигналов межклеточных взаимодействий, и переноса их на системы ответной реакции клетки. Важнейшей составляющей частью молекулярного механизма восприятия внешних и внутренних сигналов (сигнальная трансдукция) являются тирозиновые протеинкиназы (ТПК).
Нерецепторные ТПК (HP — ТПК) семейства Csk являются универсальными негативными регуляторами ТПК семейства Src и фосфорилируют консервативный С —концевой тирозин у всех представителей этого семейства [Okada & Nakagava, 1989; Nada et al., 1991; Okada et al., 1991; Bergman et al., 1992; Ruzzene et al., 1994]. Эксперименты с индуцированным мутагенезом (генный нокаут) в гене csk продемонстрировали важнейшую роль Csk в как в раннем эмбриональном развитии, в частности на стадии нейруляции [Imamoto & Soriano, 1993; Nada et al., 1993], так и в развитии и дифференцировке лимфоидной линии гемопоэтических клеток [Gross et al., 1995].
кДНК второго представителя Csk семейства HP—ТПК, Bhk/Chk, была недавно клонирована в нашей лаборатории из фракции очищенных гемопоэтических стволовых клеток мыши [Эршлер и др. 1994]. Эта киназа обладает значительной структурной гомологией с хорошо изученной Csk, а также имеет перекрывающуюся субстратную специфичность.
В экспериментах in vitro показано, что Chk мыши, также как и Csk, может фосфорилировать регуляторний тирозин 505 протеинкиназы Lck, принадлежащей к семейству Src киназ [Klages et al., 1994; Chow et al., 1994]. Гомолог Chk человека, MATK/HYL, обладает способностью
фосфорилировать Src киназу по регуляторному тирозину in vitro [Avraham et al., 1995].
Экспрессия гена chk в популяциях гемопоэтических стволовых клеток и коммитированых предшественников [Эршлер и др. 1994], а также важнейшая роль в лимфопоэзе ближайшего структурного гомолога Csk, предполагает возможность существования определенной функции Chk в процессе кроветворения. Chk обладает способностью регулировать активность целого ряда молекул сигнальной трансдукции in vitro, поэтому можно предположить, что эта киназа участвует либо в контроле многих процессов межклеточных взаимодействий, либо в одном определенном процессе, но в различных клеточных линиях. В связи с этим представляет собой актуальную задачу выяснение роли Chk в гематопоэзе, а также сопоставление этой роли с функцией Csk в одних и тех же клеточных популяциях гемопоэтической системы.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение функциональной роли HP—ТПК Chk в гемопоэзе с помощью метода направленного индуцированного мутагенеза, или генного нокаута. Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1) "Клонирование геномной копии chk из библиотеки ДНК мыши. 1) Создание плазмидного конструкта для индукции инактивирующеи мутации с помощью направленной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках.
3) -Получение мышей, гомозиготных по инактивирующеи мутации в гене
chk. Подтверждение отсутствия активной Chk в этих мышах.
-
Изучение клеточного состава крови и иммуноцитохимический анализ клеточных популяций в гемопоэтических органах и тканях мутантных и нормальных мышей.
-
Функциональное тестирование гемопоэтических клеток с генотипом chkT /chk'.
Научная новизна и практическое значение работы. В настоящей работе был инактивирован ген нерецепторной тирозиновой протеинкиназы Chk в мышах методом направленного мутагенеза, или генного нокаута. С помощью Нозерн — гибридизации и метода обратной транскрипции —
полимеразной цепной реакции (ОТ —ПЦР) было продемонстрировано отсутствие транскрипта, кодирующего активную Chk в мышах, гомозиготных по индуцированной мутации. Показано, что делеция региона, кодирующего каталитический домен Chk, приводит к повышению уровня экспрессии chk в мозге. Анализ мутантных мышей показал отсутствие нарушений в эмбриональном развитии, а также дефектов в составе периферической крови и клеточных популяций гемопоэтических тканей и органов. Иммуноцитохимический субпопуляционный анализ на основе экспрессии специфических поверхностных антигенов продемонстрировал, что инактивирующая мутация в гене chk не приводит к заметным количественным изменениям в компартменте ранних предшественников гемопоэтических клеток.
Ряд функциональных тестов, таких как измерение клоногенной активности в среде с метилцеллюлозой (КОЕ—К тест), КОЗБ —анализ, а таюке анализ клеток, инициирующих долговременную культуру in vitro (LTC — 1С), не выявил резких качественных отличий в популяциях гемопоэтических предшественников с генотипом chkr/chk~, что говорит о вырожденности функции Chk в гемопоэзе. Отсутствие активного фермента может компенсироваться наиболее близким структурно — функциональным гомологом Csk, который обладает также сходным тканевым спектром экспрессии.
Однако стромальная культура лимитирующих разведений мутантных клеток костного мозга позволила выявить значительные количественные изменения в популяции миелоидных коммитированных .предшественников. Одним из причин наблюдаемого эффекта индуцированной мутации может являться усиление адгезии гемопоэтических клеток к клеткам стромы и/или к синтезируемому ими внеклеточному матриксу. Исчезновение компенсации инактивации Chk при культивировании лимитирующих разведений клеток костного мозга свидетельствует о существовании гуморальных взаимодействий между различными гемопоэтическими клетками в процессе кроветворения.
Данная работа вносит вклад в изучение функциональной роли HP—ТПК Chk в гематопоэзе. Исследование молекул сигнальной трансдукции может быть использовано в поисках рациональных путей терапии при нарушениях
кроветворения различной этиологии, включая ряд форм злокачественных
заболеваний.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах