Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных проблем современной биологии является изучение механизмов блока пролиферации в терминально дифференцированных клетках.
Терминально дифференцированные клетки не синтезируют ДНК как в организме, так и в культуре, несмотря на наличие в среде ростовых факторов. Это позволяет предположить наличие в таких клетках специальных механизмов, удерживавших их в нереплицирующем состоянии.
Для исследования блока репликации в терминально дифференцированных клетках применяет метод клеточной гибридизации (CM.Zelenln and Prudovsky, 1989 1. Этот метод дает возможность обнаруживать в дифференцированных клетках наличие факторов, препятствующих репликации ДНК в ядрах пролиферируюших клеток-партнеров.
Отталкиваясь от результатов, полученных методом клеточной гибридизации, можно в дальнелшем перехолить к выделению и биохимической характеристике негативных регуляторов пролиферации.
Интересную информацию дает использование клеток культур, трансформированных различными онкогенами, для гибридизации с дифференцированными клетками. Таким образом удается выявить влияние онкогенов на чувствительность клеток к негативным регуляторам пролиферации, а также зависимость реактивации синтеза ДНК в ядрах дифференцированных клеток от активности онкогенов.
Анализ блока репликации в дифференцированных клетках методом клеточной гибридизации был проведен для макрофагов, ядерных эритроцитов и миоцитов (см. Zelenln and Prudovsky,1989 і.
Особый интерес представляют данные, полученные в опытах с макрофагами, которые оказались неспособными подавлять репликацию в ядрах пролиферируюших клеток (Prudovsky et.al., 1985).
В настоящей работе проведены аналогичные исследования на сегментоядерных лейкоцитах (СЛ і из перитонеальной полости мыши, подавляющее большинство которых представлено неитрофилами, имеющими общее происхождение с макрофагами.
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что несмотря на близкое родство нейтрофилов и макрофагов, механизмы, ответственные за блок пролиферации этих клеток, по-видимому различаются.
8 %
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Конкурсе работ молодых ученых Института молекулярной биологии АН СССР (1990 год); X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (1990, Гродно); IV Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Пер спективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (1990, Рига); III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (1989, Москва).
Структура диссертации. .Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы В списке литературы 84 наименования, из них 62 иностранных источника. Работа содержит страниц, включая 22 рисунка и 13 таблиц.
ГК - гетерокарион.
СЛ - сегментоядерный лейкоцит.
ЭФМ - эмбриональный фибробласт мыши.
ЭФК - эмбриональный фибробласт крысы.
1. Клетки
Выход СЛ в перитонеальную полость стимулировали,инъецируя самкам мышей СВА интраперитонеально за 1 ч до получения экссудата 0,5% раствор крахмала. Очистку СЛ от других клеток экссудата проводили в градиенте плотности Перколла по методу іDe Weger et. al, 1983). Очищенная фракция содержала не менее 96Я СЛ, среди которых, как показало окрашивание по Романовскому, не менее yet были неятрофилами. Партнерами СЛ по слиянию были клетки, имеющие различный пролиферативныи потенциал: эмбриональные фибробласты мыши 1ЭФМ) и крысы (ЭФЮ.иммортализованные клетки NIH3T3, Е2 и NIH3T3, трансформированные онкогеном v-myc іЗТЗтусі, а также малигнизированные клетки NCC-2, L-929, SV3T3 и Не239.
Культуры ЭФМ и ЭФК получали по Адамсу (1983) с некоторыми модификациями. Культуры NIH3T3 и NCC2 были любезно предоставлены нам В.С.Прасоловым (ИМБ АН СССР), а культура Е2 - Т.В.Поспеловой
- A -из Института цитологии АН СССР (Ленинград).
L клетки клона L-929 были получены из лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИМБ АН СССР. Клетки SV3T3 мы получили от П.М.Чумакова ІИМБ АН СССР). Культура клеток Не239 была любезно предоставлена нам Г.И.Деячман из Института канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР.
2.Слияние клеток
Для получения гетерокарионов использовали метод электрослияния при центрифугировании, разработанный в Институте электрохимии им.'А.Н.Фрумкина АН СССР (Абидор и др., 1989, Sukharev 1989). В отдельных опытах были использованы также метод электрослияния в монослое и метод слияния с помошыо инактивированного вируса Сендая.
Метод электрослияния при центрифугировании был выоран как основной после апробирования других методов слияния. Было обнаружено, что при слиянии СЛ с клетками культуры с помощью полиэти-ленгликолея как в суспензии, так и в монослое, происходит быстрая гибель большинства СЛ, а индекс слияния (процент гетерокарионов в культуре) оказывается низким ( 4S). При слиянии клеток с помощью вируса Сендай гибель СЛ выражена очень слабо, но и индекс слияния невелик 16*). Хороший индекс слияния (12) при достаточно высокой жизнеспособности клеток был достигнут при электрослиянии в суспензии в процессе центрифигугирования.
3. Идентификация гетерокарионов и изучение синтеза ДНК и РНК.
Идентификация гетерокарионов не представляла сложности ввиду явных морфологических отличий ядер СЛ (сегментированных или кольцевидных) от ядер клеток-партнеров по слиянию (овальных или круглых). Через 24 и 46 ч в гетерокарионах, как правило, сохранялась характерная морфология ядер СЛ. Клетки для исследования окрашивали красителем Гимза, выявляющим структуру цитоплазмы и ядра. Синтез ДНК исследовали авторадиографически по включению "Н-тими-дина. В препаратах гетерокарионов, меченных Н-тимидином, определяли следующие показатели: 1) доля меченых неслившихся клеток культуры 'І,': 2) доля меченых ядер в гомодикарионах, образованных при слиянии клеток культуры друг с другом II,); 3) доля меченых ядер клеток культуры в гетеродикарионах с СЛ <1Д>: 4) индекс подавления
синтеза ДНК в гетерокарионах 14= ', 3 х100«; 5) индекс реактивации П.), т.е. доля меченых ядер СЛ в гетеродикарионах с мечеными ядрами клеток культуры. Синтез РНК в гетерокарионах исследовали по включению в ядра Н-уридина.
4. Энуклеация и получение кариоОридов
Энуклеацию СЛ проводили по методу Wlgler and Welnsteln 11975) путем центрифугирования СЛ при 26 000 об/мин в содержавшем цито-халлаэин В (10 ыг/мл) градиенте плотности фиколла 400 следующего состава: 12,5%; 14%; 16*; 18«; 20%: 22%; 24%; 26%; 28%; 30%: 32%. После центрифугирования в зонах 24%-26% содержалось более 95% кариопластов. Цитопласты сосредотачивались в зонах 16%-20%.
Для получения кариобридов кариопласты сливали с ЭФМ методом электрослияния при центрифугировании.