Введение к работе
Актуальность проблеми. Исследования последних лот показали ^Фиктивность использования рибозішов н антисмыслових РНК (асРШС) дли подавления репродукции различных вирусов. Кроме того, открытие рибозішов дало совершеїшо новий инструмент для изучения экспрессии различных гонов и их регуляции в клетках. С этой точки зрения ети комплекси адресованиях рибонолинуклеотидов прудставляют собой потенциально моїцний инструмент в медицинской практике и ветеринарии., так как могут быть использованы в генной терапии, а также дают реальную возможность для создали пород трансгенных животных, устойчивых к одной или доже нескольким вирусным ШфЖЦИЯМ.
Несмотря на отдельные успехи, достигнутые в лечении и профилактике вирусных инфекций, продолжаются поиски новых подходов к борьбе с ними. К числу подобных подходов несомненно относится разработка технологии создания искусственного антивирусного иммунитета и тератш с помощью ннтисмыок'вих полинуклеошдов, ьйторио предотанляюг оооой либо аоРШС, кап ІфИрДИЧІО» таи П ИМП]'11]<ОЛ!ПГО РОИЧУЯ И І'ИбО'.ЛІМЧІЇї H.Li'rv^Timri^'!?n., молекул РНК. И определенной степени рибозим можно рассматривав! как псРНК, содорАящую кашлитичЧ'П'ИЙ центр, способную нч только свяаыватьсн с: молмкулой IКК мишени, но и енчиифичесьи ра.-руша'п ее, что даит [>»('> ґч\и-ін потенциально определенно.) проимущчечг-о перид іісГІІК, т.к. при 'лкспреесии в плитках ни чрелу^'к-н значительного их избытка.
Особую ценность риоомімам как Пччинциилышм 'ырытмиччсним
агентом придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичность. Кроме того возмокно создание рекомбинантннх илазмид обладающих аддитивностью и тканеспецифичностыо. Наличие технологии получения трансгенннх животных делает использование плазмидных конструкций с генами рибозимных РНК в сельском хозяйстве весьма актуальным.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание рибозим-кодирувдих конструкций, способных эффективно ингибировать репликацию вируса лейкоза коров в культуре клеток. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Разработать простую и, надежную систему In vitro для
детекции уровня репродукции ВЖ.
2. Создать генно-инженерные конструкции, несущие
рибозим-кодирующий ген под контролем различных промоторов.
3. Испытать антивирусное действие полученых конструкций в
условиях разработанной модельной системы in vitro.
Научная новизна и практическая значимость.
В настоящей работе впервые показана способность рибозима, направленного против R-области ITR BLV, расщеплять вирусную РИК in vitro и ингибировать его репликацию в культуре клеток.
Первая часть данной работы посвящена созданию анти-BLV рибозима и изучению условий его оптимальной работы In vitro.
Вторая часть работы связана с разработкой простой и надежной системы тестирования уровня репликации BLV в культуре клеток. Впервые была получена линия клеток FLK-BLV-SEAP, в которой продукция секретируемой щелочной фосфатази связана с уровнем вирусной репликации. Полученная линия позволяет легко тестировать
влияние различных ингабирущих агентов на репликацию BLV. На заключительном этапе раОоти Шли сконструировали рекомоинантние нлазмиды несущие ген рибозима. Котрансфекция дашшх конструкций в клетки СС8І с инфекционной вирусной ДНК и и FLK-BLV-SKAP сопровождается синтезом рибозимной РНК, обуславливающей эффективное подавление репродукции BLV. Максимальный уровень ингибирования составил 90-95* при весовом соотношении вирусного генома и плаэмида с рибозимом I/IO при трансфекции клеток CC8I и Г>7 на Зсм чашку при трансфекции клеток FLK-BLV-SEAP для плаэмиды pCMVR.
Таким образом впервие поісазана сіюсооность рибозима против R-области BLV подавлять его репродукцию In vitro.
Работа представляет не только научный, но и практический интерес, так как плазмиды с генами рибозимов, обладающие ыисокоЛ антивирусной активностью могут быть использованы для получении трансгешшх животных, устойчивых к вирусу Hi.V.
Апробация работы. Материал! диссертации доложыш и обсуждены на конференциях "Всесоюзное рабочее совещании по молекулярной биологии ДЯК -содержащих вирусов, имеицих практическое значение для с/х и мьлинини" (Киев [991), "Новейшие методы биоинконерии." (Москва 1994).
Публикации. Основные результаты диссертации отражены в трех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа из: введении, глав "Обзор литературы", "Материалы и мчтиды", "Результаты", "Обсуждение . результатов", "Выводаи и списка литературы, включанцего Г/0 бильної рафичосних ссыпок. Работ!)