Введение к работе
Актуальность проблемы. Флуоресцентное маркирование является одним из наиболее используемых способов выявления результатов биоанализа в иммунологическом и гибридизационном анализе. Синтетическая доступность индодикарбоцианиновых красителей, их химическая устойчивость и фотостабилыюсть, высокие коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции делают их подходящими маркерами для анализа олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов Благодаря поглощению и флуоресценции в ближнем ИК-диапазоне, индодикарбоцианиновые красители являются оптимальными для маркирования биомолекул, так как биоматериал в диапазоне длин волн 600-1200 нм имеет низкую собственную флуоресценцию, что приводит к уменьшению фонового сигнала и, следовательно, увеличению чувствительности регистрации флуоресцентного маркера. В качестве источника света для индодикарбоцианиновых красителей используют сравнительно недорогие полупроводниковые лазеры, характеризующиеся высокой интенсивностью свечения, что приводит к повышению флуоресцентного сигнала.
Одним из важнейших требований, предъявляемых к красителям, является возможность их ковалентного связывания с маркируемыми веществами, в данном случае, с олигонуклеотидами и белками. Для этих целей наиболее подходящей реакционноспособной группой является карбоксильная Введение различных заместителей в гетероциклические фрагменты флуорофора, изменение места присоединения реакционноспособной карбоксильной группы и длины полиметиленовой цепочки, отдаляющей карбоксильную группу от флуорофора, приводит к изменению физико-химических свойств маркера
Целью исследования является разработка метода синтеза асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, содержащих карбоксиалкильную группу и различные заместители в индолепиновом ядре, а также изучение влияния этих функциональных групп на спектрально-люминесцентные характеристики красителей, предназначенных для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов. В соответствии с поставленной целью в работе предполагалось решить следующие основные задачи:
1. Разработка метода синтеза индодикарбоцианиновых красителей, а также их активных производных, необходимых для получения флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров, белков и трифосфатов нуклеозидов
2 Синтез асимметричных индодикарбоцианиновых красителей с карбоксиалкильной группой (карбоксибутил - положение 3 или карбоксиэтил - положение 5) и различными заместителями в положениях 1, Г, 5, 5', 7' индолениновых фрагментов.
-
Выявление влияния расположения и природы заместителей в гетероциклических фрагментах на спектральные характеристики красителей
-
Маркирование индодикарбоцианиновыми красителями олигонуклеотидных праймеров, белков, трифосфатов нуклеозидов и испытание полученных флуоресцентно меченых продуктов в технологии биологических микрочипов
Научная новизна. Разработана схема синтеза и отработаны препаративные методики получения 6-метил-7-оксооктановой кислоты, которая послужила основой для синтеза индоленинов с карбоксибутильной группой в положении 3 и различными заместителями в положениях 1 и 5. На их основе синтезировано 32 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителя с реакционноспособной карбоксильной группой, расположенной в положении 3 и отдаленной от индоленинового фрагмента на тетраметиленовую цепочку атомов.
Разработана схема синтеза и отработаны препаративные методики получения гидрохлорвда 4-(2-карбоксиэтил)фенилгидразина, который послужил основой для синтеза индоленинов с карбоксиэтильной группой в положении 5 и различными заместителями в положении 1 На их основе синтезировано 7 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, у которых реакционноспособная карбоксильная группа расположена в положении 5 и отдалена от индоленинового фрагмента на диметиленовую цепочку атомов
Выявлено влияние расположения, природы и количества функциональных групп в индолениновых фрагментах на спектрально-люминесцентные свойства синтезированных красителей Отработаны методики синтеза, выделения и очистки N-гидроксисукцинимидньгх эфиров индодикарбоцианиновых красителей
Синтезировано 39 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, которые различаются гидрофильными свойствами, максимумами поглощения и флуоресценции, значениями квантового выхода флуоресценции и молярного коэффициента экстинкции, суммарным электрическим зарядом.
Практическая значимость работы. Выявленные в ходе работы закономерности изменения спектрально-люминесцентных характеристик в зависимости от природы и расположения функциональных групп могут быть использованы для синтеза индоцианиновых красителей с заранее заданными свойствами
Синтезированные индодикарбоцианиновые красители прошли испытания в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН. Для технологии биологических микрочипов был выбран наиболее подходящий флуоресцентный маркер - натриевая соль 3-(4-карбоксибутил)-3,3',3'-триметил-1,Г-Ди(4-сульфонатобутил)-индодикарбоцианина Этот краситель в виде ЛР-гидроксисукцинимидного эфира нашел применение для маркирования синтетических олигонуклеотидов и белков, и вошел в состав сертифицированных коммерческих диагностических тест-систем в виде флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых антител.
набор реагентов для выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности к рифамшщину и изониазиду (ТБ-биочип), к фторхинолонам (ТБ-биочип-2),
набор реагентов для выявления и диагностики генетической предрасположенности к развитию некоторых онкологических заболеваний и для определения индивидуальной чувствительности к ряду лекарственных препаратов (ПФ-биочип);
набор реагентов для одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови (ОМ-биочип), для определения общей и свободной форм простат-специфического антигена (ОМ-биочип-ПСА).
Апробация работы. Результаты работы были представлены в XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), на X международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004» (Волгоград, 2004), на X молодежной конференции по органической химии (Уфа, 2007) Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов РАН
Публикации. По материалам диссертации получен международный патент на изобретение, опубликовано 6 статей в ведущих международных и отечественных научных журналах, 3 тезисов докладов на конференциях
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 1ТЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части^ выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит A>fl схем, oL5 рисунков и і 5 таблиц Список цитируемой литературы включает А/Р наименований.
