Идентификация антигенных детерминант вируса гепатита С с помощью синтетических пептидов Фирсова, Татьяна Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Гепатит С -. одно из наиболее опасных заболеваний человека, в основном, поражающее печень, развивающееся вследствие передачи с кровью этиологического агента инфекции - вируса гепатита С (HCY). Специфическая диагностика вирусного гепатита С является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире, в особенности, чрезвычайно важной для ограничения распространения HCV-инфекции посредством зараженных продуктов крови.

Одним из путей создания эффективных диагностических препаратов против вирусных инфекций является конструирование их на основе искусственных антигенов, в качестве которых могут использоваться как рекомбинантные белки, так и синтетические пептиды - фрагменты вирусных белков.

Использование синтетических пептидов в качестве антигенов в диагностических системах создает широкие возможности для специфического скрининга анти-НСУ-антител. Идентификация антигенных детерминант в составе вирусных белков является первым этапом в конструировании диагностику'мов нового поколения, основанных на синтетических пептидных антигенах.

Цели и задачи исследования. В настоящей работе мы поставили своей целью поиск пептидных антигенов - фрагментов белков HCV - для анализа структурной организации вирусных В-зпитопов и создания им-муноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к HCV. '

Поставленная цель подразумевала решение следующих задач:

предсказание вероятных В-эпитопов в составе белков HCY на основе компьютерного анализа гидрофильности и расчета вторичной структуры;

химический синтез выбранных пептидных фрагментов твердофазным методом, очистка полученных пептидов с помощью гель-хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ;

сравнительное исследование антигенной активности синтетических пептидов в непрямом твердофазном ИФА путем изучения антигенного профиля сывороток крови пациентов с HCV-инфекцией и определение сайтов связывания со специфическими анти-HCV-антителами;

разработка способа иммуноферментной диагностики вирусного гепатита С, основанного на использовании наиболее перспективных в

антигенном отношении пептидов в качестве сорбируемых на твердую фазу антигенов.

Научная новизна. В диссертационной работе, представленной к рассмотрению, впервые были синтезированы и охарактеризованы В-эпи-топы HCV в составе белка нуклеокапсида и неструктурных белков NS3 и N35, которые имеют гомологию в аминокислотной последовательности и обладают идентичной вторичной структурой.

Изучена антигенная структура районов, ограниченных аминокислотными остатками (а.о.) 20-34 и 39-75 белка core и а.о. 1689-1732, соответствующими области 5-1-1 белка NS4 HCV. Продемонстрированы возможности выявления анти-HCV-антител с помощью пептидов - фрагментов исследованных областей.

Епервые идентифицирована антигенная детерминанта в С-концевой части белка NS4 на участке, частично перекрывающемся с областью ре-комбинантного антигена clOO-З и показана высокая диагностическая значимость данного района.

Впервые был установлен характер влияния аминокислотных замен на участках 110-116 и 1711-1732 на антигенную активность соответствующих пептидов и получены данные о возможности серотипирования HCV-инфекции.

Разработан новый способ иммуноферментной диагностики гепатита С с использованием синтетических пептидов из состава белка NS4 HCY как дополнительных антигенов к рекомбинантному HCcAg, позволяющий выявлять сыворотки, не содержащие анти-core-антител. В настоящее время данная разработка внедряется в производство.

Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную ра-, боту, мы преследовали цели как фундаментального, так и прикладного характера. К первому направлению можно отнести идентификацию анти-телосвязывающих сайтов в составе белков вируса, играющих роль в формировании антигенной структуры HCV. Изучение предполагаемой вторичной структуры этих сайтов и определение роли отдельных аминокислотных остатков является базисом в дальнейших исследованиях по молекулярной иммунологии HCV.

Практическая ценность данной работы состоит в получении пептидных антигенов - фрагментов белков HCV для создания иммуноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к HCV. ,

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Твердофазным методом синтезированы 28 пептидов из состава

- З -белка core и неструктурных бзлков NS3, NS4 и NS5, из них 26 ранее не были описаны.

1. Исследованы антигенное свойства пептидов в твердофазном ИФА на панелях HCV-положительных и HCY-отрицательных сывороток и выявлены пептиды, позволяющие с высокими чувствительностью и специфичностью выявлять антитела к HCV.

2. Изучена антигенная структура районов, ограниченных а.о. 20-34 и 39-75 белка core и а.о. 1689-1732, соответствующего области 5-1-1 белка NS4 HCV. Продемонстрированы возможности выявления анти-HCV-антител с помощью пептидов - фрагментов исследованных областей. Показано, что сайты узнавания анти-HCY-антителами локализуются по всей длине области 5-1-1, а наибольшей антителосвязывающей способностью обладает олигопептид, соответствующий изолятам HCV с субтипом lb и ограниченный а.о. 1711-1732.

3. Продемонстрирована высокая диагностическая значимость района, ограниченного а. о. 1930-1940, не входящего в область сЮО-3. Показано, что с помощью пептида, соответствующего а.о. 1921-1940, и его фрагментов можно определять в крови анти-НСУ-антитела, которые не выявляет рекомбинантный антиген сЮО-3.

4. Локализованы не описанные ранее В-зпитопы, соответствующие районам 110-116 белка core, 1274-1280 белка NS3 и 2665-2671 белка NS5, которые содержат консенсусный мотив -Asp-Pro-X-Y-Arg- в первичной последовательности и обладают идентичной вторичной структурой. Установлены отличия в'антигенной активности пептидов 110-116 и 1274-1280, соответствующих различным субтипам HCV.

5. Разработан новый способ диагностики HCV-инфекции на основе использования в качестве антигена для иммуноферментного скрининга анти-НСУ-антител смеси рекомбинантного HCcAg и синтетических олиго-пептидов, соответствующих а.о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Пастера в г. Санкт-Петербурге (1993 г.), на Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" в г. Перми (1993 г.), на Научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Академии медицинских наук в г. Москве (1994 г.) и на Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (1993 г., Токио). Результаты работы доложены и обсуждены на совместной Конфе-

- 4 -рецции Отдела молекулярной вирусологии и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАШ 1 декабря 1994 г.

Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 4ЬО стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы /V таблицами, / рисунками и № схемами. Список литературы включает // наименований.