Введение к работе
Актуальность темы. Нерадиоактивные молекулярно-биологаческие методы детекции быстро вытесняют радиоизотопные методы анализа. Эта тенденция берет начало с середины 70-х годов, когда нерадиоактнвный метод конъюгации фермент-антитело (ELISA) потеснил радиоиммунологию. Главная проблема в развитии нерадиоактивных систем для ДНК и РНК детекции - возможность модификации нуклеиновой кислоты детектирующим компонентом таким образом, чтобы это не влияло на гибридизационные свойства первой. К сожалению, методы, разработанные для кросс-сшивки или флюоресцентного мечения белков не всегда применимы для нуклеиновых кислот. Главными реакционноспособными группами в белках являются первичные амины, тиолы, карбоксигруппы - т.е. те, которые относительно легко подвергаются модификации.
Ни ДНК, ни РНК не содержат подобного рода функциональных групп. Обычным местом атаки флюоресцентной молекулы являются аминогруппы нуклеиновых оснований или фосфатные остатки.
Опубликованные химические методы флюоресцентного мечения ДНК/РНК предполагают первоначальное создание активных центров на молекуле нуклеиновой кислоты с последующей обработкой этих центров активированными красителями. Главным преимуществом подобного рода мечения составляет весьма низкая стоимость реагентов по сравнению со стоимостью флюоресцентно-меченых трифосфатов, используемых для ферментативных процедур. К сожалению, места создания активных центров в нуклеиновых кислотах весьма немногочисленны. Более того, большая часть подобного рода методов, как то аминирование фосфатных групп, либо переаминирование цитозина и проч. включает краситель по всей длине цепи ДНК (РНК), что не всегда благоприятно для дальнейшего использования флюоресцентно-меченных продуктов, например, в гибридизационных экспериментах. Помимо этого, для проведения количественного анализа образца эффективность мечения не должна зависеть от длины фрагментов. Последнее условие может быть выполнено предпочтительнее при химическом введении метки (исключающем ферментативные реакции).
Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось создание и оптимизация метода флюоресцентного мечения ДНК, позволяющего проводить фрагментацию с последующим введением флюоресцентного красителя.
В работе были поставлены следующие задачи:
-определить оптимальные условия введения диаминов а также аминосодержащих флюоресцентных красителей в частично апуринизованную ДНК с полной или частичной фрагментацией последней;
-определить условия иммобилизации и гибридизационные свойства ДНК, содержащей образовавшиеся первичные аминогруппы, в полиакриламидном геле;
-используя первичные аминогруппы апуринизованной ДНК, появляющиеся в нуклеиновой кислоте процессе восстановительного присоединения диаминов, провести флюоресцентное мечение образцов рибосомной кДНК ряда
I
микроорганизмов и выявить для них оптимальные условия дискриминации паттернов гибридизации.
Научная новизна работы. Впервые предложен вариант введения флюоресцентного красителя в ДНК по апуриновым участкам. Флюоресцентное мечение может сопровождаться либо полной, либо частичной фрагментацией ДНК по местам включения красителя, в зависимости от желания экспериментатора. Введение диамина в цепь ДНК как патента для последующего присоединения активированного красителя делает метод весьма универсальным, в то же время метод позволяет проводить флюоресцентное мечение нуклеиновой кислоты путем непосредственной обработки апуриновой ДНК аминосодержащим красителем.
Методы носят универсальный характер: незначительные модификации процедуры позволяют проводить мечение как ДНК, так и РНК.
Описанные методы введения флюоресцентных красителей в полинуклеотидную цепь были использованы для флюоресцентного мечения ДНК и РНК ряда микроорганизмов. Впервые была проведена идентификация различных видов бактерий путем гибридизации их тотальной и рибосомной РНК на микроматрице.
Впервые в полиакриламидном геле была проведена иммобилизация ДНК по апуриновым участкам.
Практическая ценность работы. Описанные методы введения аминогрупп в ДНК и РНК имеют универсальный характер и позволяют проводить не только реакции флюоресцентного мечения нуклеиновых кислот, во и использовать активированные подобным образом нуклеиновые кислоты в ряде других практических приложений. Одним из вариантов такого рода приложений является, например, иммобилизация ДНК в полиакриламидном геле. В перспективе это может быть использовано для анализа библиотек клонов кДНК.
Описаные методы мечения могут быть легко автоматизированы и использованы на производстве.
Публикации. По Материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop V (Santa Fe, New Mexico, USA, 1996), а так же на конференцях "Microfabncation Technology for Research and Diagnostics" (San Francisco, California, USA, 1996) и "Advances in Labels, Signaling & Detection (Improving Sensitivity, Accuracy and Speed)" (San Diego, California, USA, 1997).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяти разделов: Введение, Обзор литературы, Результаты и их обсуждение, Материалы и методы и Выводы. Работа изложена на 91 странице и содержит 13 рисунков, 16 схем и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 119 работ.