Введение к работе
Актуальность проблемы. Распространение генношшэнерных методов на получение направленно модифицированных белков дает в руки исследователей мощный инструмент изучения структурно-функциональных отношений этого класса соединений и открывает перспективу конструирования белков с программируемыми свойствами как для исследовательских целей, так и для решения задач практической медицины. Все большее распространение получают диагностические и вакцинные субъеданичные препараты на основе рекомбинантных генноинженерных белков. Использование методов биоорганической химии расширяет возможности направленного конструирования белков с заданными физико-химическими и иммунологическими свойствами, открывая, в частности, перспективу создания комплексных мульти-функционалъных иммуногенов, сочетающих в своем составе наборы различных антигенных детерминант. Первые препараты такого плана, представляющие собой сочетания синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам, конъюгированных с различными носителями, уже исследуются в-ряде лабораторий. Нам представляется более перспективным другой подход, основанный на использовании белковых химер с иммуноспецифичностью, заданной введением в определенные положения белковой молекулы чужеродных антигенных детерминант. В свою очередь, развитие этого подхода требует разработки как методов конструирования таких гибридов, так и обеспечения их эффективной экспрессии (в частности, в прокариотах).
Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка методов направленного конструирования гибридных белков программируемой иммуноспецифичности, содержащих короткие участки иммунодоминантных эпитопов, обеспечивающие специфическую антигенность и/или иммуногенность. Такие гибридные белки в перспективе могут быть использованы для диагностики и иммунопрофилактики вирусных заболеваний. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
-Выявить иммунодоминантные участки вирусных белков для включения в состав комплексных иммуногенов;
-Подобрать белки-носители, обеспечивающих как экспонирование введенного участка, так и возможность сочетанного проявления иммуногенных свойств;
-Разработать удобные методы получения синтетических олиго-нуклеотидов, кодирующих иммунодоминантные эпитопы вирусных бел-
- 2 -ков, и способы введения этих олигонуклеотидов в экспрессирующие конструкции;
-Сконструировать системы экспрессии гибридных белков с заданной иммуноспецифичностыо;
-Исследовать физико-химические и иммунологические свойства гибридных белков, оценить перспективность полученных соединений как диагностических и иммунопрофилактических препаратов.
Научная новизна работы.
-В работе впервые предложено конструирование гибридных белков направленной иммуноспецифичности, задаваемой введением в ген белка синтетических олигонуклеотидов, кодирующих иммунодоминант-ные участки чужеродных вирусных белков.
-Разработаны методы получения и введения в состав экспрес-сируюшего вектора как мономерных, так и олигомерных полинуклео-тидных дуплексов, кодирующих антигенные детерминанты ряда белков вирусов гепатита В и ВИЧ-1.
-Осуществлено конструирование нескольких серий плазмид, детерминирующих синтез в прокариотических системах гибридных белков с чужеродными антигенными детерминантами.
-Показано, что в полученных гибридных белках введенные антигенные детерминанты располагаются на поверхности частиц, формируемых этими белками, и конформация введенных участков обеспечивает возможность их взаимодействия с соответствующими антителами. Иммунизация животных белками на основе HBcAg, содержащими фрагменты preS-области HBV, вызывает продукцию антител как к HBcAg, так и к детерминантам preS.
Практическая ценность работы.
-В ходе работы выявлены иммунологически активные участки preSl- области поверхностного белка HBV и HDAg HDV.4TO делает возможным создание диагностических препаратов на основе соответствующих синтетических пептидов или гибридных белков, содержащих эти участки.
-Показано, что гибридный белок, кодируемый плазмидой pEXLG, обеспечивает эффективное выявление ВИЧ-положительных сывороток и может быть использован как компонент тест-системы на ВИЧ-1. Использование гибридов .-галактозидазы с эпитопами различных белков ВИЧ позволяет исследовать представительство антител на от-
- з -дельные антигенные детерминанты вируса в сыворотках инфицированных
-Получение капсидоподобных частиц на основе HBcAg с экспонированными антигенными детерминантами preS-области или белков ВИЧ открывает перспективу разработки нового поколения иммунопро-филактических средств направленной специфичности.
Основные положения, вынооза» на защиту.
-
Один из иммунодоминантных участков preSl- области вируса гепатита В локализован между 31 и 35-м аминокислотными остатками белка
-
Область 65-80-й аминокислот белка HDAg содержит иммунодо-минантный эпитоп этого белка.
-
Модификация Н-фосфонатного метода химического синтеза оли-годезоксирибонуклеотидов на носителе, заключающаяся, в использовании пластиковых колонок и минимизации объема реакционной смеси, снижающей расход реактивов, позволяет эффективно проводить синтез олигонуклеотидов с длиной цепи до 55 звеньев в неавтоматизированном режиме.
-
Использование полученных химическим и химико-энзиматичес-ким синтезом олигонуклеотидов, кодирующих антигенные детерминанты вирусных белков, позволяет направленно вводить чужеродные антигенные детерминанты (в виде мономеров или олигомеров) в заданные положения белков-носителей, обеспечивая получение гибридов с заданными антигенными свойствами. Такие гибриды могут быть использованы для дифференциальной диагностики серологических маркеров вирусной инфекции.
-
Гибридные белки на основе HBcAg с введенными в их состав детерминантами других белков могут вызывать образование у лабораторных животных антител как против детерминант носителя, так и против введенных иммунодоминантных участков, что позволяет рассматривать такие белки как потенциально применимые для разработки комплексных мультивалентных иммуногенов, сочетающих в своем составе В- и Т-эпитопы различных белков.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пу-щино-на-Оке, октябрь 1986 г.; Международной конференции "фундаментальные и прикладные вопросы СПИД, вирусных гепатитов и грип-
- 4 -па", Суздаль, 25-30 сентября 1988г.; IX Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений. Рига, 15-18 мая 1990 г.; Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов, Юрмала, 10-12 апреля 1990 г.; Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты" Ростов, 3-8 сент. 1990 г.; I и II Всесоюзных планово-отчетных конференциях "Генная и клеточная инженерия", ноябрь 1990, декабрь 1991 г. ,Пущино-на-0ке; I Съезде иммунологов России. Новосибирск, 23-25 июня 1992 г.