Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы "Этапы развития сравнительных гибридизационных методов и их место в современных структурно-функциональных исследованиях геномов и транскриптомов" 8
2.1. Вычитающая гибридизация - принцип метода 8
2.2 Вычитающая гибридизация без применения ПЦР 10
2.3 Вычитающая гибридизация с использованием ПЦР 14
2.4 Representational Differential Analysis и современное искусство вычитания 16
2.4.1. RDA - проблемы и пути их решения 18
2.4.2. Применение RDA в геномных сравнениях 19
2.4.3. Применение RDA для сравнения кДНК 21
2.4.4. Метил-чувствительный репрезентативный дифференциальный анализ (MS-RDA) 22
2.4.5. Направления усовершенствования RDA 24
2.4.6. Разделение фрагментированных геномов по длине - метод упрощения геномов 25
2.5. In Gel Competitive Reassociation - 1GCR " 27
2.6. Эпоха ПЦР-супрессии 28
2.6.1. Вычитающая гибридизация кДНК (Suppressive Subtractive Hybridization, SSH) 31
2.6.2. Вычитающая гибридизация геномных ДНК 36
2.6.3. Нормализация и истощение библиотек кДНК 39
2.6.4. Coincidence cloning 42 2.7 Заключение 53
3. Материалы и методы 54
3.1 Стандартные методики 54
3.2 Ткани, клеточные линии, штаммы, космиды 54
3.3 Компьютерный анализ 55
3.4 Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма штаммов М. tuberculosis 56
3.5 Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма байкальских сиговых 57
3.6 Методы, используемые при изучении метилирования локуса FXYD5-COX7A1 (Chr 19) 59
3.7 Методы, используемые для получения набора последовательностей M.tuberculosis, транскрибирующихся в легком мыши 63
3.8 Методы, используемые при изучении олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице 65
4. Результаты и обсуждение 66
4.1 Вычитающая гибридизация близкородственных геномов 66
4.1.1. ПДРФ-вычитающая гибридизация 66
4.1.2. Полногеномное сравнение различных штаммов M.tuberculosis 71
4.1.3. Геномное сравнение близкородственных видов байкальских сиговых 96
4.2 Метод клонирования идентичных последовательностей 104
4.2.1.Метод клонирования идентичных последовательностей для анализа тканеспецифического метилирования протяженных геномных локусов 105
4.2.2 Rapid Identification of Genomic Splits 115
4.2.3. Распределение неметилированных сайтов в локусе FXYD5-COX7A1
хромосомы 19 в нормальной и опухолевой тканях легкого, а также клеточной линии А549 129
4.2.4. Анализ бактериального транскриптома внутриклеточных патогенов in vivo 138
4.3. Использование олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице как зондов в молекулярной биологии 145
4.3.1 Комбинации SBO в качестве объединенных праймеров для секвенирования 148
4.3.2 Использование модифициролванных олигонуклеотидов в ПЦР 150
4.3.3.Использование модифицированных олигонуклеотидов в RAPD 152
5. Выводы 154
6. Список литературы
- Вычитающая гибридизация с использованием ПЦР
- Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма штаммов М. tuberculosis
- Полногеномное сравнение различных штаммов M.tuberculosis
- Использование олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице как зондов в молекулярной биологии
Введение к работе
Структурно-функциональные и сравнительные исследования геномов попрежнему остаются основой молекулярной биологии и генетики. Все методы таких исследований условно подразделяют на две большие группы: методы прямого секвенирования и методы несеквенирующего сравнительного анализа. Современное секвенирование включает серию высокотехнологичных масштабных методов, позволяющих определять в короткие сроки последовательности десятков и сотен миллионов нуклеотидов. Однако полностью решить проблемы полногеномного исследования только прямым секвенированиемвряд ли возможно, поскольку в геномах (особенно эукариотических) имеются локусы, недоступные для клонирования, определения первичной структуры ДНК или однозначной реконструкции протяженных фрагментов из-за наличия большого числа гомопоследовательностей, GC-богатых участков и/или повторов. Так, например, в «окончательном» варианте генома человека, опубликованном International Human Genome Sequencing Consortium в 2004г., оставалось более чем 340 участков, для которых не была определена первичная структура. Кроме того, полногеномное секвенирование остается очень дорогим методом, и всестороннее изучение громадной геномной вариабельности посредством секвенирования с точки зрения материальных затрат в настоящее время и в обозримом будущем нереально.
Методы, относящиеся ко второй группе, основанные на использовании свойства ДНК образовывать устойчивые двухцепочечные структуры из комплементарных одноцепочечных молекул, получили название гибридизационных. Среди гибридизационных подходов в частности активно используются различные виды микроэрреев, позволяющие в значительной степени интенсифицировать исследования при снижении временных и стоимостных затрат. Несмотря на широкое распространение в мире и успешное применение для решения самых разнообразных задач геномики, микроэррейные технологии имеют серьезные недостатки: недостаточная специфичность гибридизации на твердой подложке, а также большое количество ложнопозитивных сигналов, возникающих при взаимодействии повторяющихся элементов генома, семейств генов и других неоднозначных участков, проблемы при анализе транскрибирумых на низком уровне кДНК и сложности с дискриминацией различных вариантов сплайсинга. Существенным ограничением метода является обязательность знания нуклеотидной последовательности геномастандарта, без чего невозможно сконструировать микроэррей, а в сравниваемых со стандартом исследуемых геномах невозможно детектировать последовательности, присутствующие в исследуемом геноме, но отсутствующие в стандарте.
Преимущества гибридизации в растворе перед гибридизацией на твердом носителе основаны на преимуществах кинетики второго порядка, а также возможности выделения продуктов гибридизации из смеси для последующего анализа или же проведения дополнительного раунда гибридизации, что существенно увеличивает эффективность процедуры. Методы дифференциального гибридизационного анализа геномов и продуктов их экспрессии можно классифицировать по конечному результату, который они позволяют получить, на (i) методы описательного анализа фрагментов различий сравниваемых объектов (геномов или отдельных участков
геномов) и (ii) методы физического вьщеления дифференциальных фрагментов.
К описательным методам относят методы анализа различий определенных геномных локусов, например, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) (Pearson, 1985) и методы полногеномного анализа (геномная дактилоскопия (DNA fingerprinting) (Tautz, 1990); ПЦР с произвольно выбранными праймерами (RAPD) (Welsh and McClelland, 1990), (Johnson et al., 1994); кросс-гибридизация (cross- hybridizing) (Gershon et al., 1989).
К группе методов, нацеленных на физическое вьщеление фрагментов ДНК, содержащих различия между геномами, можно отнести дифференциальный дисплей (для обзора CM.(Broude, 2002)) и методы, объединенные общим названием «вычитающая гибридизация». Методы этой группы дают возможность прямого получения библиотек различий сравниваемых геномов или продуктов их экспрессии, поэтому в результате их использования возможно быстрое получение структурной информации о различиях между объектами и ее использование для дальнейшего функционального анализа.
Таким образом, по-прежнему актуальными являются разработка и совершенствование гибридизационных методов анализа геномов, которые могли бы расширить возможности уже существующих методов, в частности, позволили бы с с высокой эффективностью идентифицировать дифференциальные последовательности геномных ДНК и характерные особенности сравниваемых транскриптомов.
Вычитающая гибридизация с использованием ПЦР
Ранее было показано, что около 80% последовательностей, содержащихся в Y хромосоме, являются гомологичными у самок и самцов, а 20% последовательностей не дают перекрестной гибридизации с ДНК из других хромосом (Bishop et al., 1983). Так как размер Y-хромосомы составляет примерно 1,7% от мышиного генома, то до вычитания процентное содержание фрагментов мишени должно составлять 0,34%. Полученная величина 13% означает, что обогащение произошло примерно в 40 раз.
Данная работа заложила основу для всех последующих исследований, которые заключаются в гибридизации двухцепочечных драйвера и трейсера и использовании ренатурировавшей двухцепочечной фракции, обогащенной последовательностями мишени, для последующих операций.
В 1985 году Kunkel и соавторы (Kunkel et al., 1985) использовали вычитающую гибридизацию в работе, которая сыграла важную роль в локализации гена мышечной дистрофии Дюшенна. Авторы использовали ту же методику, что и в предыдущей работе, вплоть до использования той же рестрикционной эндонуклеазы Mbol для расщепления трейсера. В качестве трейсера была использована ДНК из линии лимфоидных клеток человека, а в качестве драйвера - ДНК (в 200 кратном избытке) пациента с делецией 3 500 т.п.о. в коротком плече X хромосомы. Авторы объединили вычитающую гибридизацию с методом PERT (фенол-ускоренная реассоциация ДНК), который увеличивает скорость реассоциации в тысячи и в даже десятки тысяч раз (Kohne et al., 1977). Анализ 81 уникального фрагмента из клонированных реассоциировавших молекул ДНК показал, что только 4 из них (5%) - фрагменты ДНК, которые отсутствуют у больного мышечной дистрофией Дюшенна. Обогащение, таким образом, достигло 15. Несмотря на высокую скорость реассоциации, достигаемые значения обогащения невелики. Вьщеление фрагментов мишени оказалось возможным за счет того, что делетированная часть имела большие размеры.
В последующие годы другие группы также использовали метод, предложенный Lamar и Kunkel ем, для поиска последовательностей из делеций аналогичного размера в различных районах хромосом человека (Nishi et al., 1992), (Smith et al., 1987).
В рамках той же стратегии, хотя и с использованием другой рестрикционной эндонуклеазы для расщепления трейсера и драйвера была получена библиотека, обогащенная последовательностями, которые были делетированы у больного с хориодермией (Nussbaum et al., 1987). Авторы описали эксперименты с образцами ДІЖ из двух семей, в которых хориодермия, слабоумие и глухота были сцеплены с X хромосомой. В образцах из первой семьи XL-62 была цитогенетически найдена делеция (1 250 т.п.о.) внутри Xq21. Во второй семье, XL-45, делеция не была выявлена, также не было найдено никаких сцепленных маркеров. Однако подобие фенотипов пораженных болезнью мужчин в двух семьях позволяют сделать предположение, что образцы из второй семьи XL-45 также имели делецию. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы применили фенол-ускоренную реассоциацию для обогащения последовательностей ДНК из делетированного района. Используя метод вычитающей гибридизации, авторы выделили два фрагмента ДНК, которые отсутствовали в образцах XL-45 и XL-62. Эти клоны были первыми шагами на пути к идентификации гена хориодермии.
Такой же метод вычитающей гибридизации, основанный на модификации метода фенол-ускоренной реассоциации, был использован для выделения множественных амплифицированных последовательностей из клеток нейробластомы человека (Shiloh et al., 1987) и карциномы желудка (Мог et al., 1991). Если в ранних работах (Kunkel et al., 1985,Lamar and Palmer, 1984) поиск мишеней имел успех за счет больших размеров делеций, то в последних двух работах такую роль сыграла множественная амплификация мишени (достигнутые величины обогащений были небольшие, но процентное содержание мишени было достаточно для поиска подходящих клонов).
Используя ту же стратегию ВГ, Лисицын и соавторы (Lisitsyn et al., 1990a,Lisitsyn et al., 1990b) попытались выделить человек-специфические последовательности, проводя вычитание ДНК человека и шимпанзе, и получили последовательность человек-специфического геномного повтора. Другой группе исследователей (Ueda et al., 1990) также удалось выделить уникальную последовательность, присутствующую в геноме человека и отсутствующую в геноме шимпанзе.
Как уже отмечалось, в рассмотренных выше работах достигаемые степени обогащения мишени в полученных библиотеках были невелики, существенно меньше, чем соотношения драйвера и трейсера, поэтому эти методы не годились для поиска небольших различий между сложными геномами. Поэтому исследователи активно искали способы усовершенствования ВГ, и революционным событием стало введение ПЦР-амплификации для выделения обогащенной фракции молекул-мишеней.
Примерно в одно и то же время две группы стали независимо использовать ПЦР в сочетании с вычитающей гибридизацией (Wieland et al., 1990), (Straus and Ausubel, 1990). В обеих группах использовалась традиционная схема вычитания двухцепочечного трейсера и двухцепочечного драйвера, но Wieland с сотр. оценивали обогащение мишеней по их содержанию в одноцепочечной, не успевшей ренатурировать, фракции, a Straus и Ausubel — по содержанию в двухцепочечной фракции. В обеих работах использовалось несколько циклов вычитания. Обе работы использовали биотинилирование драйвера или трейсера для специфического отделения трейсера от драйвера (Wieland et al., 1990) или трейсера от драйвера и образовавшихся гибридов (Straus and Ausubel, 1990).Обе работы использовали ПЦР для того, чтобы амплифицировать обогащенный трейсер после нескольких раундов вычитания. При этом в работе линкеры для последующего ПЦР были лигированы к трейсерной ДНК либо до проведения ВГ (Wieland et al., 1990), либо после (Straus and Ausubel, 1990).
По контрасту с этими работами Лисицын с соавторами разработали протокол ВГ, в котором для амплификации трейсер-специфических дуплексов использовались 5 выступающие одноцепочечные адаптеры (Lisitsyn et al., 1993b) (рис 2). Для создания таких выступающих адаптерных концов использовали дуплекс, образованный нефосфорилированными на 5 конце олигонуклеотидами. После лигирования такого дуплекса с фрагментами ДНК, содержащими 5 -фосфатные группы, только одна из цепей адаптера ковалентно связывалась с фрагментом ДНК, а вторая — денатурировала.
После ренатурации только образующийся двухцепочечный трейсер, обогащенный мишенью, содержал такие адаптерные "хвосты" на двух концах. Концы достраивались ДНК-полимеразой и только такие достроенные молекулы могли участвовать в экспоненциальной ПЦР-амплификации с праймером, идентичным адаптерной последовательности. Это нововведение было чрезвычайно важно, поскольку позволяло селективно амплифицировать только дуплексы мишеней, дискриминируя их от одноцепочечных, гибридных и драйверных дуплексов. В I модельном эксперименте по выделению фрагментов плазмидной ДНК, добавленной к геномной ДНК E.coli в молярном соотношении 1:1, авторам потребовалось только 2 раунда гибридизации.
Методы, использованные в изучении геномного полиморфизма штаммов М. tuberculosis
Образцы геномной ДНК сравниваемых штаммов (0.5 мкг каждый) были гидролизованы Alul (Fermentas). К полученным рестриктным фрагментам лигировали адаптер I, состоящий из дуплекса нефосфорилированных олигонуклеотидов NotlAlu и Not2Alu предварительно отожженного в ТМ-буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 10 мМ MgCh). После лигирования проводили препаративную наработку фрагментов ПЦР с праймером NotlAlu по следующей программе: достройка 5 концов - 72 С, 2 мин, затем 95 С, 15 сек; 68 С, 30 сек; 72 С, 1 мин; 10-13 циклов. Продукты амплификации были фракционированы на агарозном геле (0.8% агароза LMPA, USB). Фракцию фрагментов длиной до 600 п.о. элюировали из геля с помощью QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Препаративные количества этой фракции (5 мкг) были получены амплификацией с праймером NotlAlu и использованы в качестве драйвера. Образец трейсера получен удалением последовательности NotlAlu и лигирования к образовавшимся фрагментам адаптера II, состоящего из нуклеотидов Stl9 и St20. Образцы трейсера и драйвера смешивали в соотношении 1:500, лиофилизовали, растворяли в 4 мкл буфера (10 мМ EEPS, 1 мМ EDTA, рН 8.0). Наслаивали минеральное масло (20 мкл). Денатурировали при 99 С в течение 3 мин, после чего добавляли 1 мкл 5 М NaCl. Гибридизацию проводили в течение 18 ч. при 68 С. Трейсер-специфические последовательности были селективно амплифицированы праймером Stl9 при следующих условиях ПЦР: "fill-in" (72 С, 3 мин), затем 20 циклов (95 С, 15 сек; 68С, 30 сек; 72 С, 1 мин).
Полученные продукты амплификации лигировали в вектор pGEM (Promega), клонировали в компетентные клетки E.coli, штамм DH5cc, создавали ранжированные клонотеки в 96-луночных планшетах (минимально по 5 планшетов для каждого вычитания).
Анализ кпонотек методом дифференциальной дот-блот гибридизации Индивидуальные клоны в каждом планшете были амплифицированы с праймером St 19 (95С, 30 сек; 68С, 30 сек; 72С, 1 мин; 25 циклов), продукты реакции были перенесены на нитроцеллюлозные мембраны (АРВ) в двух повторах согласно стандартной методике. Приготовленные мембраны использовали для гибридизации отдельно с ДНК трейсера и драйвера, меченными радиоактивно с использованием Prime-a-Gene Labeling System (Promega). Гибридизацию проводили при 68С, в течение ночи.
ПЦР проводили на матрицах геномной ДНК исследуемых штаммов (10 нг) в следующем режиме: денатурация (95 С, 20 сек), отжиг (56 С, 30 сек), элонгация (72 С, 1 мин), 25 циклов. Продукты амплификации анализировали на 1% агарозном геле.
Образцы ДНК сига и омуля (по 500 нг) гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Rsal (20 ед. акт., Fermentas). Рестрицированную ДНК осаждали 96% этанолом, осадок промывали 70% этанолом, растворяли в 10 мкл воды. Проводили разделение рестрикционных фрагментов по длине в 1 % агарозном геле (АРВ), вырезали зону, соответствующую фрагментам длиной 200-800 п.о. Выделение ДНК из агарозного геля проводили с использованием QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Полученную фракцию фрагментированной геномной ДНК сига разделяли на две части, к каждой из которых лигировали олигонуклеотидные адаптеры I (состоящий из TTNotSrf и Srf_10) и II (Т7 NotRsa и Rsa_10). Каждый адаптер был получен отжигом соответствующего олигонуклеотида и короткой подложки (по 200 пмоль каждого) в ТМ-буфере (10 мМ Трис-НС1, рН 7.8, 10 мМ MgCb). Лигирование проводилось в течение ночи при 16 С с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (Promega, США), после чего лигазную смесь очищали с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, США).
Рестрикционные фрагменты сига с различными лигированными адаптерами (трейсер) смешивали по отдельности с 700 нг рестрикционных фрагментов омуля (драйвера) в 2 мкл 1х гибридизационного буфера (ГБ, 0.5 М NaCl, 50 MM HEPES, рН 8.3, 0.2 мМ EDTA) (получили смеси I и II), покрывали 20 мкл минерального масла, денатурировали 10 мин при 95С и гибридизовали 4 ч при 68С. Далее к смеси I добавляли сначала 2 мкл (700 нг) денатурированного драйвера (в 1х ГБ), а затем гибридизационную смесь II. Полученную смесь гибридизовали еще в течение ночи при 68С, затем добавляли 100 мкл 1х ГБ и хранили при -20С. Аликвоту (20 мкл) полученной гибридизационной смеси инкубировали 5 мин при 72С с Taq-полимеразойв присутствии 0.2 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатовдая достройки выступающих одно цепочечных концов, очищали на колонках QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и обрабатывали 5 ед. акт. нуклеазы золотистой фасоли (Promega) 15 мин при 37С в 10 мкл 1х соответствующего реакционного буфера. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8). 2 мкл полученной смеси амплифицировали с помощью Advantage2 Polymerase Mix (Clontech) с использованием внешнего адаптерного праймера Т7 (концентрация 0.4 мкМ) при следующих условиях: 95С - 30 сек, ббС - 30 сек, 72С - 90 сек, 18 циклов. Разбавленный в 250 раз ПЦР-продукт реамплифицировали с внутренними адаптерными праймерами NotRsa и NotSrf (концентрация по 0.4 мкМ) при условиях: 95С - 30 сек, 68С - 30 сек, 72С - 90 сек, 15 циклов.
Полногеномное сравнение различных штаммов M.tuberculosis
. После достройки проводились всего 10-13 циклов ПЦР амплификации полученной ДНК во избежание ПЦР селекции. Данный этап был введён в начале процедуры вычитания для того, чтобы наборы фрагментов ДНК, использующиеся в гибридизации, были получены одинаковым образом, что делает корректным процесс сравнения двух геномов. Затем продукты ПЦРбыли электрофоретически разделены в агарозном геле. Участки геля, содержащие фрагменты геномных ДНК длиной от 100 до 600 п.о. были вырезаны, после чего ДНК выделяли из геля. Полученные наборы фрагментов ДНК необходимой длины использовали для препаративной ПЦР амплификации с праймером Notl Alu.
На данном этапе заканчивается получение препаративного количества образца геномной ДНК (в количестве 6-7 мкг), который используется в качестве драйвера. Образец ДНК трейсера после ПЦР амплификации-с праймером Notl Alu подвергался дальнейшим манипуляциям.
Приготовление трейсера Полученные после препаративной наработки наборы рестриктных фрагментов ДНК трейсера были гидролизованы рестрикционной эндонуклеазой Alul по восстановленным в ходе лигирования первого адаптера сайтам рестрикции. Проверка полноты рестрикции показала, что более 95% всей ДНК после второй рестрикции не содержало адаптеров. После этого к 5 -концам полученных двухцепочечных ДНК лигировали новый адаптер, состоящий из олигонуклеотидов Stl9 и «подложки» St20, которая впоследствии диссоциировала.
Проведение вычитающей гибридизации Образцы драйвера и трейсера, содержащие фрагменты ДНК определённой длины, смешивали в молярном соотношении 500:1, а затем подвергали совместной денатурации (99С, 3 мин) и длительной ренатурации (68С, 16 часов). При этом образовывались три типа молекул: гетеродуплексы «драйвер/трейсер», гомодуплексы «драйвер/драйвер» и гомодуплексы «трейсер/трейсер» или «мишени». После проведения вычитающей гибридизации трейсер-специфические мишени были селективно амплифицированы с использованием праймера Stl 9. Непосредственно перед амплификацией проводилась достройка выступающих концов фрагментов ДНК, при этом только гомодуплексы мишеней образовывали два концевых участка, комплементарных последовательности праймера, что обеспечивало их экспоненциальную амплификацию. Обогащение мишеней после вычитающей гибридизации проводили, используя такое количество циклов ПЦР, на котором обеспечивался большой выход продукта, и не происходило заметной ПЦР селекции определённых последовательностей ДНК.
Полученная смесь фрагментов ДНК, обогащенная трейсер-специфичными фрагментами, была лигирована в вектор pGEM и трансформирована в компетентные клетки Е. coli штамма DH5a, библиотеки потенциально дифференциальных клонов были ранжированы в 96-луночные планшеты. Анализ полученных библиотек дифференциальных фрагментов проводили методом дифференциальной гибридизации.
Для анализа каждого планшета было приготовлено две идентичные нитроцеллюлозные мембраны с иммобилизованными на них продуктами ПЦР-амплификации фрагментов. Одна мембрана гибридизовалась с радиоактивно меченым зондом, приготовленным из ДНК трейсера, а вторая, соответственно, с зондом из ДНК драйвера.
Дифференциальными считают клоны, которые не дают сигнала при гибридизации с драйвером, но успешно гибридизуются с трейсером, пример дифференциальной гибридизации приведен на рис 17.
Определение первичной структуры клонированных последовательностей проводилось по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводился с помощью международной базы данных BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ). Особое внимание уделялось наличию остатков сайта рестрикции Alul, а также последовательности олигонуклеотидного адаптера Stl9, использовавшегося после проведения вычитающей гибридизации для амплификации трейсер-специфическихгомодуплексов.
Важной проблемой на настоящий момент является высокая фенотипическая изменчивость популяции М. tuberculosis. Штаммы этого микроорганизма имеют различную лекарственную устойчивость и патогенные характеристики, вызывая туберкулёз разной степени тяжести. Это связано прежде всего с изменчивостью ряда генов, определяющих вирулентность патогена. Такая изменчивость обеспечивает постоянное возникновение новых вариантов штаммов внутри рассматриваемого вида.
В настоящее время применяется множество экспериментальных подходов, позволяющих группировать штаммы М. tuberculosis согласно их геномным характеристикам и проводить определение неизвестного штамма, относя его к той или иной генотипической группе. Существующие методы генотипирования основаны на полиморфизме повторяющихся последовательностей генома, в частности, на различиях в числе копий и мест интеграции мобильных элементов (метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) геномной ДНК микобактерий с использованием последовательности транспозона IS67/0 в качестве гибридизационного зонда называется «IS-RFLP типирование»), полиморфизме GC-богатых повторяющихся последовательностей (PGRS), различном числе тандемных повторов (VNTR) в составе рассеянных по геному микобактериальных повторяющихся элементов (MIRU) (метод MIRU-VNTR-типирования), вариациях в структуре специфического участка микобактериального генома, содержащего множественные короткие прямые повторы длиной 36 п.о. (DRs) и расположенные между ними уникальные спейсеры длиной от 35 до 41 п.о. (методом сполиготипирования определяется наличие этих уникальных последовательностей). Методы генотипирования, базирующиеся на повторяющихся элементах генома или на коротких некодирующих последовательностях (в случае сполиготипирования), позволяют успешно классифицировать штаммы М. tuberculosis и широко применяются в современной диагностике заболевания (Kanduma et al., 2003). Тем не менее, эти методы не позволяют соотносить структурную вариабельность патогена с его функциональными характеристиками: Такое функциональное генотипирование, использующее вкачестве маркёров вариабельные кодирующие последовательности генома, имеет большие преимущества как в исследовании эволюционных отношений между штаммами, так и поиске генов,- ответственных за, возникновение и течение заболевания, так называемых факторов вирулентности. Высокоэффективный и надёжный метод диагностики также может быть основан на знании кодирующих геномных последовательностей, специфических для-отдельных штаммов данного патогена.
Использование олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной матрице как зондов в молекулярной биологии
Среди генов семейства ттаА1-4, кодирующих синтетазы метоксимиколовой кислоты (methoxy mycolic acid synthase), экспрессируются 3 гена из 4. Индукция генов этого семейства в мышиных фагосомах не раз отмечалась разными авторами. Предполагается . участие этих генов в поддержании гидрофобности клеточной стенки (Rachman et al., 2006).
В геноме М. tuberculosis выделяется кластер генов поликетидсинтаз,/ &їі-і7, белковые продукты которого также вовлечены в процесс синтеза фтиоцерола или фенилфтиоцерола, хотя их точная функция не установлена. В нашем эксперименте получены данные об экспрессии б из 16 генов этого семейства. Индукция генов семействаpfcy при развитии инфекции в макрофагах продемонстрирована разными группами авторов (Waddell and Butcher, 2007), (Waddell et al., 2005), (Sirakova et al., 2003). В частности, показано, что продукт гена pks2 принимает участие в синтезе сульфолипидов (Sirakova et al., 2001)
Чрезвычайное значение для функционирования микобактерий имеют белки, ассоциированные с поликетидсинтазами (polyketide synthase associated proteins, генырарА!-5), продукты которых являются ацилтрансферазами: Предполагается, что они могут осуществлять этерификацию трегалозы или её производных. В геноме эти гены существуют в виде нескольких функциональных оперонов, содержащих также гены семейства pks и семейства мембранных белков mmpL. Нами показана экспрессия 3 генов из 5, входящих в это семейство.
Транскрибирующиеся гены также были сгруппированы согласно их вовлечению в различные метаболические пути (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG, http://www.genome.ad.ip/kegg/kegg2.htmK Приложение 11). В рассматриваемом нами случае хронической инфекции микобактерий остаются метаболически активными, о чем свидетельствует транскрипция генов, входящих в основные метаболические пути, такие как липидный метаболизм (метаболизм жирных кислот), углеводный метаболизм, окислительное фосфорилирование, аминокислотный метаболизм. Активно транскрибируются гены сигнальной трансдукции, которые предположительно отвечают за бактериальный ответ на внешние стимулы. Подобный метаболический профиль был описан для генов, экспрессирующихся в легких мышей линии BALB на 60 день инфекции (Talaat et al., 2007). Гены метаболизма дыхательных путей
Несмотря на то, что резкого увеличения количества транскрибирующихся генов этой категории не отмечено, наблюдается перераспределение транскрипции генов, соответствующих переходу микобактерий с аэробного дыхания на анаэробный (Shi et al., 2005). Отмечается экспрессия генов, входящих в narGHIJ оретоп, кодирующий нитрат-редуктазы (экспрессируются гены narH, narl, narj), а также пагХи пагКЗ, кодирующие переносчики нитратов. Для такого сдвига в дыхании бактерии, находящейся в хронической фазе инфекционного процесса, характерно снижение активности АТФ-синтезирующего аппарата, что проявляется в снижении транскрипции генов, находящихся в кластере atpA-H, транскрибируется только ген aptD.
Гены информационных путей (вовлеченные в репликацию, репарацию и транскрипцию ДНК) Транскрипция генов, кодирующих рибосомальные белки, и вовлеченных в биосинтез ДНК, немного понижена по сравнению со средним значением, что может указывать на замедление репликации бактериальных клеток. По-видимому, этот факт отражает свойства хронической стадии инфекционного процесса, связанной с ослаблением бактериального роста. Такой факт отмечают ряд авторов, например, при сравнении транскрипции генов этой категории в дендритных клетках по сравнению с in vitro (Tailleux et al., 2008).
Таким образом, в целом, проанализированный бактериальный транскриптом действительно качественно и количественно соответствует хронической фазе инфекционного процесса и адаптации М tuberculosis к иммунной системе хозяина.
Принципиальной основой использования олигонуклеотидов как зондов в молекулярной биологии является образование стабильного дуплекса с комплементарной последовательностью ДНК. Возможность варьирования, то есть увеличения или уменьшения стабильности таких дуплексов при сохранении специфичности взаимодействия позволяет существенно увеличить их потенциал в исследованиях структуры и функций генетического материала.
Существует много возможностей модифицировать углеродно-фосфатный остов, фосфатные группы или гетероциклические основания. В нашей работе использован опыт синтеза олигонуклеотидов с модифицированными гетероциклическими основаниями, полученный в группе проф. В.К. Потапова.
Нами исследованы олигонуклеотиды, содержащие 5-метилцизозин (т5С) и 2-аминоаденин (am2А) вместо цитозина и аденина соответственно. Известно, что стабильность пары диаминопурин-тимидин увеличивается за счет появления дополнительной водородной связи (Cheong et al., 1988), а пары 5-метилцитозин-гуанин — за счет гидрофобных взаимодействий метильной группы в большой бороздке спирали ДНК (Hoheisel et al., 1990), при этом происходит увеличение температуры плавления комплементарного дуплекса примерно на 1 С на модифицированное звено в обеих случаях (рис. 47).
Нами было впервые осуществлена характеристика таких олигонуклеотидов (Strongly Binding Oligonucleotides, SBO) с точки зрения их сродства к комплементарной ДНК матрице в матричном синтезе. Мы использовали олигонуклеотиды, имеющие последовательность универсального праймера M13for с немодифицированными основаниями (1), полной заменой С на m С (2) и полной одновременной заменой СиАнатСиатА соответственно (3) для определения первичной структуры ДНК по Сенгеру. В качестве матрицы использовали одноцепочечную ДНК бактериофага М13тр18. Эксперименты показали, что модифицированные олигонуклеотиды более эффективно праймируют матричный синтез ДНК по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами той же структуры. Специфичность синтеза сохраняется, поскольку картина распределения полос на радиоавтографах во всех 3 случаях одинакова (радиоавтографы не приведены в диссертации).
Для определения минимальной длины SBO, способного эффективно праймировать синтез мы оценили эффективность синтеза ДНК, праймированного модифицированными и немодифицированными пента-и гексамерами по количественной оценке включения d[P32]-dATP во вновь синтезированную цепь (рис.48). Анализ включения d[P32]-dATP продемонстрировал, что пентамеры, как нормальной структуры, так SBO, не эффективны в качестве праймеров. Гексамеры продемонстрировали достаточно хорошую эффективность затравки, однако, SBO более эффективны, даже при повышенных температурах реакции.