Геномная нестабильность и пролиферативное старение при образовании иммортальных соматических гибридов человек-мышь Лупатов, Алексей Юрьевич

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Применение соматической гибридизации позволило обойти межвидовой барьер репродуктивной изоляции, существующий на уровне целостных организмов, и получать клеточные гибриды не только между близкими видами, но и отдаленными систематическими группами. Особое место среди межвидовых соматических гибридов занимают гибриды человек-мышь. Полученные на их основе клеточные линии широко используются в качестве источника хромосом человека для решения целого ряда научных задач. Однако, чем меньше филогенетическое родство партнеров по слиянию, тем более остро проявляется нестабильность гибридного генома. В случае гибридов, полученных при слияіши клеток человека и клеток грызуна, геномная нестабильность выражается в постепенной утрате (сегрегации) хромосом человека. Дополнительный вклад в геномную нестабильность могут вносить экзогенные селективные маркеры, которые широко используются для селекции гибридных клонов. При их использовании возможна дополнительная дестабилизация генома из-за амплификации векторной плазмиды и ее распространения по хромосомам, увеличения ломкости хромосом в местах интеграции или других причин, связанных с присутствием экзогенной ДНК (Pritchard, Goodfel-lo\v,1987; Gosden, Porteous, 1987).. Нестабильность гибридного генома может играть существенную роль в образовании иммортальных гибридных клонов при использовании клеток человека, имеющих . ограниченный пролиферативиый потенциал, в качестве партнера для межвидовой соматической гибридизации с иммортальными клетками грызунов. Механизм, посредством которого образующийся гибридный клон преодолевает пролиферативное старение, требует специального изучения, так как для внутривидовых соматических гибридов показано доміширование «смертного» фенотипа над иммор-тальным (Bunn, Tarrant 1980). Таким образом, актуальным представляется изучение в рамках одной работы вопросов, связанных как с различными аспектами геномной нестабильности габридов, так и с проблемой пролиферативного старения при формировании гибридных клонов. Подобное исследование может не только углубить теоретические представления о процессах протекающих при образова-

ний межвидовых соматических гибридов и, следовательно, оптимизировать их практическое использование, но и способствовать пониманию таких фундаментальных биологических явлений как клеточное старение и канцерогенез.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение геномной нестабильности и пролиферативного стареїшя при образовании клеточных клонов межвидовых соматических гибридов. В качестве объекта исследования использовали гибриды эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ), несущих экзогенный селективный маркер пео, с трансформированными фнбробластоподобными мышиными клетками линии А9.

Исходя из цели исследования были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Получить набор клонов ЭФЧ, несущих экзогенный селективный маркер пео, используя трансфекцию кольцевой либо линеаризо-ваной плазмиды pSV2neo.

2.Получить набор иммортальных гибридных клонов человек-мышь в результате слияния клеток различных клонов ЭФЧпео* и мышиных клеток линіш А9.

1. Изучить особенности сегрегации хромосом в полученных гибридах и влияние на этот процесс экзогенной маркерной ДНК.

2. Сравнить количество хромосомных транслокаций в гибридах, полученных с использованием экзогенного и эндогенного селективных маркеров.

3. Оценить влияние пролиферативного потенциала ЭФЧ на эффективность образования гибридов человек-мышь.

4. Оценить репликативный потенциал индивидуальных хромосом человека в гибридах, полученных при слиянии с клонами ЭФЧпео¹¹, находящимися на разных стадиях пролиферативного старения.

5. Проверить гипотезу об участии теломеразы в образовании иммортальных гибридных клонов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые продемонстрирована возможность образования клеточных клонов, несущих экзогенный селективный маркер и несодержа-щих человеческого хромосомного материала, в результате соматической гибридизации клеток мыши и ЭФЧ, трансфицированных плаз-мидой pSV2neo. Обнаружена клональная гетерогенность клеточной линии мыши по способности инициировать нестабильность экзогенного маркера, интегрированного в хромосомы партнера по слиянию. Показана необходимость наличия пролиферативного потенциала родительских клеток, а также расходование регашкативного потенциала отдельной хромосомы, принадлежащей мортальному партнеру, при образовании иммортальных гибридных клонов. Полученные результаты углубляют понимание механизмов клеточного старения, а также могут быть использованы при получении соматических гибридов для картирования генома человека.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены на конференции «Геном человека-91» (Переславль-Залесский, 1991 ); на совещании «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1992), а также на конференции «Геном человека-93» (Черноголовка, 1993).

Структура и объем диссертации.