Введение к работе
Актуальность темы
Одним из новых направлений создания диагностических и профилактических препаратов сегодня является конструирование капсидных структур с заданными антигенными и иммуногенными свойствами. Это осуществляется посредством экспонирования чужеродных иммунологических эпитопов на поверхности вирусных капсидных частиц, образующихся в результате самосборки мономеров белка оболочки. В настоящее время в роли капсидных белков -носителей чужеродных эпитопов - используют HBsAg [Delpeyroux et al.,19863 и HBcAg [Borisova et aZ.,19893 вируса гепатита В, белок оболочки вируса табачнсй мозаики [Haynes et al.,19863 и другие капсидные белки. Совершенно новый объект, как универсальный носитель эпитопов, представляет собой белок оболочки (БО) РНК-содержащих бактериофагов В. coll, который образует икосаэдрический капсид фагов, состоящий из 180 одинаковых субъединиц.
Целью настоящей работы ставилось изучение возможностей использования капсидного белка РНК-содержащих бактериофагов в качестве носителя чужеродных эпитопов. Для достижения этой цели был проведен сравнительный анализ первичных и вторичных структур БО РНК-содержащих бактериофагов Е. coll, а также, на его основе -экспериментальный генно-инженерный мутагенез БО бактериофага fr на предмет выявления его участков, пригодных для внедрения чужеродных последовательностей.
Научная новизна работы заключается в том, что предложен новый объект для белковой инженерии вирусных капсидных структур - БО РНК-содержащих бактериофагов В. colt. В частности, на примере БО фага fr из 1-й серологической группы фагов показано, что он может быть использован в качестве носителя для внедрения в него чужеродных последовательностей, включая и вирусные иммунологические эпитопн. Впервые показана возможность создания как полноразмерных фагоподобных частиц, несущих чужеродные последовательности, так и интермедиатных структур самосборки, образующихся в результате ассоциации рекомбинантных мономеров в мультимерные частицы нескольких классов (от димеров до цельных капсидоподобных частиц, состоящих из 180 субъединиц).
Практическая значимость работы.
1. Сконструирован пакет новых векторов, предназначенных для
клонирования чужеродных последовательностей, в том числе и вирусных
иммунологических эпитопов, по N- и С-концам БО fr, а также для
экспрессионного картирования клонированных эпитопов.
2. Получены штаммы-продуценты белков, представляющих собой БО fr, в
который внедрены активные иммунологические эпитопы, пригодные для
практического использования: участки preS вируса гепатита В
человека (HBV), оболочечного белка gp51 вируса лейкоза крупного
рогатого скота (BLY), трансмембранного белка gp41 вируса
иммунодефицита человека (HIV). Сконструированные рекомбинантные
плазмиды, кодирующие соответствующие белки, защищены авторскими
свидетельствами.
Плазмида pFR8-1-33 (вектор для внедрения по С-концу), использована В.М.Берзинем (ИОС ЛАН) для конструирования штамма-продуцента рекомбинантного БО fr, несущего активный центр а-атрио-натрийуретического фактора человека (a-AMF)i клонированный в С-конце БО fr.
Плазмиды pPR36 и pPR42 использованы Р.Ульрихом (Университет Гумбольдта, Берлин) для конструирования банка клонов, содержащих различные участки трансмембранного белка gp41 HIV-1. клонированные в аминотерминальную область БО fr.
Структура работы. Диссертация изложена на '^Ц страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвященный генноинженерному изучению вирусных капсидных структур и экспонированию на них чужеродных иммунологических эпитопов), материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы. Материал работы иллюстрирован А? рисунками. Сгшсок литературы включает /сі" источников.