Введение к работе
. Актуальность проблемы.
Растворимые цитокины фактор некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксин-альфа (ЛТ-альфа, также называемый ФНО-бета) были первоначально охарактеризованы и очищены на основании их способности убивать некоторые линии опухолевых клеток in vitro и вызывать гемморагический некроз опухолей in vivo (обзоры Beutler). После того, как были открыты мембранные рецепторы ФНО, белки массой 55 кД и 75 кД, было показано что они являются также рецепторами для ЛТ-альфа, что позволило объяснить лерекрывагше спектров активностей ФНО и ЛТ-альфа.
ФНО представляет собой мембранно-связанный гомотример белков с молекулярной массой мономера 26 кД, который может быть отщеплен от клеточной мембраны специфической протеазой, делающей его таким образом секретируемым (с мол. массой мономера 17 кД). В отличие от ФНО, ЛТ-альфа (мол. масса 20 кД) не имеет трансмембранного домена и в гомотримерной форме только секретируется. Тем не менее, ЛТ-альфа может быть локализован на плазматической мембране клетки в ассоциации с гомологичным белком, названным лимфотоксином-бета (ЛТ-бета), который содержит трансмембранный домен (Browning et al, 1993). Продукция ЛТ-альфа и ЛТ-бета специфична для лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клетки), тогда как продукция ФНО отмечена для широкого спектра клеток.
К моменту постановки диссертационной задачи в 1993 году было не ясно, насколько описанные ранее биологические активности ФНО и ЛТ-альфа соответствуют их физиологической роли в организме (Ruddle, 1992). Опубликованные к тому времени первичные данные о фенотипе мышей с инактивировашшм 55 кД ФНО рецептором выявили центральную роль этого рецептора в возникновении септического шока и в защите организма от бактериальных инфекций, но не позволили определить индивидуальный вклад каждого из лигандов (т. е. ФНО и ЛТ-альфа) в этих процессах.
Сегодня уже известны фенотипические характеристики мышей с мутациями в генах ФНО, ЛТ-альфа, ФНО/ЛТ-альфа, ФНО рецептора 55 кД, а также ФНО рецептора 75 кД (Таблица 1). Наиболее неожиданным оказался фенотип мышей, мутантных по гену ЛТ-альфа: отсутствие лимфатических узлов, пейеровых бляшек и нарушение структуры селезенки; такого фенотипа не было замечено у мышей с мутациями в обоих рецепторах ФНО. В то же время было показано, что ЛТ-альфа и ЛТ-
бета могут образовывать два разных мембранных гетеротримера: ЛТ-альфа2бета1, узнаваемый преимущественно рецепторами ФНО, и ЛТ-альфа1бета2, для последнего был найден особый рецептор, названный ЛТ-бета рецептор (Crowe et al, 1994). Эти открытия позволили предположить, что причиной дефектов развития и функциональной организации лимфоидных органов у мутантных по гену ЛТ-альфа мышей является отсутствие мембранного комплекса ЛТ-альфа/ЛТ-бета.
Таблица 1. Описанные в литературе фенотипичесте проявления мутаций в генах ФНО/ЛТлокуса и ФНО рецепторов.
Фенотип Мутация Ссылка
(ген)
Отсутствие лимфатических узлов ЛТ-альфа De Togni et al, 1994
Banks etal, 1995
ФНО, рецептор Pfeffer et al, 1993
ФНО 55 кД Rothe et al, 1993
Pasparakis et al, 1996
рецептор ФНО Erickson etal, 1994 75 кД
ФНО, рецептор Pfeffer etal, 1993
ФНО 55 кД Rothe et al, 1993
Pasparakis et al, 1996
Отсутствие маргинальной зоны в селезенке
Скопления лимфоцитов в легких и
печени
Отсутствие пейеровых бляшек
Отсутствие В-клеточных фолликулов, фолликулярных дендритных клеток и герминативных центров во вторичных лимфоидных органах
Устойчивость к ЛПС шоку (в присутствии Д-галактозамина)
Пониженная чувствительность к ФНО
Восприимчивость к инфекциям внутриклеточными бактериями
ЛТ-альфа
ЛТ-альфа
ЛТ-альфа, рецептор ФНО 55 кД ЛТ-альфа, ФНО,
рецептор ФНО 55 кД
DeTognietal, 1994 Banks etal, 1995
Banks etal, 1995
DeTognietal, 1994 Banks etal, 1995 Neumann et al, 1996 De Togni et al, 1994 Pasparakis et al, 1996 Matsumoto et al, 1996
Цель и задачи работы.
Целью данного исследования явилось изучение физиологической роли ЛТ-бета мыши. Были поставлены следующие задачи:
-
Проклонировать геномную копию мышиного ЛТ-бета; подтвердить сцепленность гена с ФНО/ЛТ локусом, проверить, является ли этот ген уникальным в мышином геноме.
-
Сконструировать вектор для делеционного мутагенеза генов ФНО/ЛТ локуса в эмбриональных стволовых (ЭС) клетках мыши.
-
Проверить применимость Cre-loxP системы сайт-специфической рекомбинации бактериофага Р1 для инактивации тесно сцепленных генов, поодиночке и в комбинациях. Получить клоны мышиных ЭС клеток с делециями в генах:
а) ЛТ-бета;
б) ЛТ-бета и ФНО;
в) ЛТ-бета, ФНО и ЛТ-алъфа.
-
Получить линии мышей с указанными выше мутациями.
-
Сравнительным фенотипическим анализом линий мышей с мутациями в генах ЛТ-бета и ЛТ-альфа исследовать роль мембранно-связанного ЛТ в развитии и функционировании имунной системы мыши.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые проклонирована и охарактеризована хромосомная копня гена ЛТ-бета мыши, показана ее уникальность в мышином геноме. Используя модифицированный метод гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках (Cre-loxP система), впервые получены линии мышей с мутациями в генах ЛТ-бета, ЛТ-бета/ФНО, ЛТ-бета/ФНО/ЛТ-альфа, и ЛТ-бега/ЛТ-альфа. Эти животные являются уникальными модельными системами, позволяющими изучать функции генов ФНО/ЛТ локуса in vivo. Сравнительным фенотишіческим анализом линий мышей с мутациями в генах ЛТ-бета и ЛТ-альфа показана роль ЛТ-альфа/бета гетеротримера в образовании пейеровых бляшек и функциональной структуры селезенки. Выявлено различие в молекулярных факторах необходимых для образования разных лимфатических узлов: в то время как для развития большинства лимфатических узлов необходим ЛТ-альфа/бета гетеротример, развитие брыжеечных и шейных лимфатических узлов может проходить в отсутствии ЛТ-бета. Кроме того, в отсутствии ЛТ-альфа/бета гетеротримера нарушена одна из центральных реакций гуморального иммунного ответа - образование герминативных центров.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 5 Международный конгресс по Фактору Некроза Опухолей и родственным цитокинам (Родос, Греция, май 1996), Международная конференция по цитокинам (Женева, Швейцария, октябрь 1996), 13 Европейский иммунологический съезд (Амстердам, Нидерланды, июнь 1997).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных журналах, а также тезисы в материалах 3 международных конференций.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает в себя /35 источника, работа проиллюстрирована /f таблицами іл.И рисунками.