Введение к работе
Актуальность темы. Механизмы, регулирующие экспрессию генетической информации, действуют на многих этапах , ведущих от ДНК к получению белка. Одним из способов регуляции экспрессии геноо как у прокариот, так и у эукариот является модуляция терминации транскрипции. Эффективность модуляции определяется последовательностью нуклеиновой кислоты и белковыми факторами, которые взаимодействуют с этой последовательностью, с РНК-полимеразой и между собой.
Наиболее хорошо охарактеризованным примером такой регуляции является система N-антитерминации в бактериофаге \ . В этом процессе участвуют клеточные факторы, и один из них, NusG, был очищен как фактор, необходимый для процессивной N-антитєрминации in vitro. Генетически nusG был идентифицирован посредством мутации nusG4, которая супрессирует мутацию nusAI для XN-антитерминации. Недавние исследования предполагают, что NusG является также фактором, необходимым для Rho-зависимой терминации в Е. соЧ. Показано участие белка NusG в процессе терминации, осуществляемой Nun-белком фага НК022; эта система является примером фактор-зависимой терминации.
' Хотя продемонстрировано физическое взаимодействие белка NusG как с Rho-белком, так и с РНК-полимеразой, механизм действия NusG и его роль в процессахтерминации и антитерминации остаются неясными. Для изучения функционирования белка NusG in vivo нами был выбран следующий подход: изменять внутриклеточную концентрацию NusG либо путем деплсции, либо суперэкспрессируя NusG в клетке с целью проследить, как изменение концентрации NusG влияет на процессы элонгации, терминации и антитерминации транскрипции.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение роли и механизма действия белка NusG из Е. coli в процессах транскрипционной элонгации, терминации и антитерминации.
Экспериментальные задачи исследования заключались в следующем'
-
Изучить влияние белка NusG на элонгацию транскрипции in vivo и in vitro.
-
Охарактеризовать in vivo взаимодействие NusG с другими белками транскрипционного комплекса.
-
Исследовать, является ли NusG необходимым фактором XN-зависимой антитерминации in vivo.
-
Локализовать участки белка NusG, необходимые для функционирования в Nun-зависимой терминации.
Научная новизна и практическая'ценность работы. В данной работе впервые продемонстрировано, что in vivo NusG участвует в процессе элонгации транскрипции и является фактором, стимулирующим элонгацию. Эффект стимуляции элонгации транскрипции белком NusG воспроизведен in vitio и является следствием супрессии пауз транскрипции белком NusG. Показано, что действие NusG на эло.:гацию и терминацию транскрипции не описывается моделью кинетического сопряжения этих двух процессов. Данные по эффекту
суперэкспрессии NusG на терминацию свидетельствуют об участии NusG в Rho-зависимой, но не в Rho-независимой терминации, и о непосредственном взаимодействии Rho и NusG. Впервые показано, что Rho-зависимая терминация в мутанте по Rho-фактору rho026, может происходить в отсутствие NusG, хотя и с пониженной эффективностью. В экспериментах по деплеции NusG показано, что этот Оелок является необходимым фактором процесса XN-антитерминации на Rho-зависимом терминаторе. Впервые отобраны мутанты NusG, нарушающие его функционирование в Nun-терминационном комплексе и показана специфичность этих мутаций.
Результаты данной работы свидетельствуют о важной структурной и функциональной роли белка NusG в элонгационном комплексе . coli, модулирующем терминацию и антиіерминацию транскрипции.
Система XN-антитерминации Е. coli на настоящий момент служит хорошей моделью для изучения механизма регуляции транскрипции в инфекционном цикле развития вируса ВИЧ-1 и в других эукариотических системах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде докладов на международных конференциях "Постинициационные функции РНК-полимеразы" (Маунтайн Лэйк, США, 1992), "Молекулярная генетика бактерий и фагов" (Колд Спринг Харбор, США, 1993) и "Молекулярная генетика бактерий и фагов" (Висконсин, США, 1994).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования, Обсуждение результатов, Выводы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 19 рисунков. Библиография включает в себя 167 названий.