Введение к работе
---1-^J. Актуальность проблемы. Обнаружение в живом мире третьей таксономической группы высшего ранга - царства архебактерий, члены которого отличаются как от истинных бактерий (эубактерий), так и от эукариот, является одним из наиболее значительных открытий естествознания за последние годы. Око во многом изменило взгляды на клеточную эволюцию и сделало очевидным важность исследования различных аспектов молекулярной организации архебактерий для решения ряда крупнейших проблем эволюционной биологии. Исследования такого рода могут совершенствовать наши представления об организации древнейших организмов, населявших Землю; они также дают возможность проследить пути эволюции жизненно-важных молекул и становления особенностей регуляции биологических процессов; существенно, что у представителей архебактерий могут быть обнаружены клеточные процессы и макромолекулы, отсутствующие у эубактерий и эукариот, а также оригинальные решения таких общих проблем, как организация генома и регуляция экспрессии генов.
Изучение молекулярных характеристик архебактерий может оказаться крайне ценным и для бистехнологических разработок. Оснований для этого утверждения более чем достаточно: многие представители архебактерий в ходе жизнедеятельности образуют метан; подавляющее большинство известных видов архебактерий существует в экстремальных условиях - экстремально высоких температурах и концентрациях солей, низких значениях рН и т.п.; свойства белков, выделенных из архебактерий, как правило, отражают экстремофилию организмов (например, ферменты, выделенные из экстремально термофильных архебактерий, высокотермостабильны и термофильны), что и определяет их высокий технологический потенциал.
Представление об архебактериях, как представителях самостоятельной линии в эволюции, было сформировано в ходе филогенетического анализа по данным количественной оценки гомологии нуклеотид-ных последовательностей Ібй(ІВз) рибосомкых РНК (v/oosa.Fox, 1977), Результаты, полученные с помощью такого малоапробированного подхода, нуждаются в подтверждении со стороны данных, более привычных для систематики; указанный подход имеет и другие недостатки, например, он не дает возможность установить в удовлетворительном приближении степень древности архебактерий и эволюционные взаимоотношения между предками современных архебактерий, эубактерий и эукариот. Для решения всех этих проблем в настоящее время важное значение имеет изучение характерных признаков фенотипа архебактерий, в частности, качественных особенностей их субклеточных структур и макромолекул.
Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в выявлении особенностей фенотипа архебактерий на молекулярном уровне. Для достижения указанной цели потребовался всесторонний анализ литературы по проблеме и проведение специального исследования некоторых компонентов генетического аппарата экстремально термофильных архебактерий, сведения о свойствах которых к моменту начала работы отсутствовали, либо носили эпизодический характер. Основной задачей исследования было изучение свойств ДНК-зависимых ДНК-полимераз, ДНК-зависимых РНК-полимераз и рестриктирующих эндонуклеаз экстремально термофильных архебактерий и структурной организации генома этих микроорганизмов, в частности, наличия в его составе структурных элементов генома эукариот. В задачи работы входило также уточнение таксономического положения в царстве архебактерий тех видов, которые служили объектом исследования.
Научная новизна работы. Впервые изучение таксономии архебактерий проведено на основании измерения параметров гетерологических
гибридов ДНК и I6s рРНК разных видов архебактерий. Предложен новый порядок царства архебактерий Ttwrmoproteuiea, объединяющий восстанавливающие серу экстремально термофильные анаэробы родов Тпо.-шо-protaus, Tlieraophilum и Daaulfurocoocua, Показано, что представители этого порядка вместе с окисляющими серу экстремально термофильными бактериями рода Sulfolobus образуют одну из двух ветвей царства архебактерий; метанобраэующие и экстремально галофильше архебактерий, а также термоацкдофия Taermoplaama acidophilua образуют вторую ветвь царства.
Впервые выделены, очищены и изучены ДКК-зависише РШС-полиме-разы из архебактерий порядка Thersioprotealeo - ИЗ Theritoproteua tenax, Desulfurococcus mucoaus и Desulfurococcus аоШіз. Показано, что по субъединичному строению и чувствительности к ингибиторам ферменты отличаются от РНК-полимераз эубактерий и проявляют сходство с РНК-полимеразами А эукариот. Показано также, что субъединичный состав РНК-полимеразы организма может служить филогенетическим маркером, отличающим представителей двух ветвей царства архебактерий. Впервые удалось осуществить la vitro асимметрическую транскрипцию ДНК архебактериальной РКК-полимеразой.
Впервые изучены ДНК-зависимые ДНК-полимеразы архебактерий. Разработаны методики выделения и очистки ферментов из термофилов Sulfolobus acidooaldarius И Therraopl acsma acidopnllum . На примере sulfolobus acidooaldarius показано, что в клетках архебактерий присутствуют три ДНК-полимеразы - А, В и С (из . Thertuopl аааа acidophilum внделена только ДНК-полимераза В), различающиеся по физико-химическим, биохимическим и иммунохимическим свойствам. Выявлено, что ДНК-полимеразы С и В имеют некоторые характерные черты зукариотических ДНК-полимераз ^ , и 0 , соответственно, а ДНК-полимераза А похожа на эубактериальные ДНК-полимеразы типа I или II.
Впервые обнаружено наличие рестриктирувдей эндонуклеаэы у архебактерии, представляющей ветвь серозависимых экстремальных термофилов - у Gulfolobuii аоіоіосаісіагіиз . Фермент, обозначенный как Sual , является изошизомером эубактериальных рестриктаз типа ВврНІ . Разработаны методики очистки фермента, исследованы его каталитические свойства.
Впервые изучен ряд особенностей структурной организации генома архебактерии. В составе геномов экстремально термофильной архебактерии suLfolobus ecidocaldailua и экстремально галофильной архебактерии nalobaoteriua haloblum обнаружены короткие участки простых последовательностей, состоящих из одного повторяющегося нуклеотида или двух тандемно повторяющихся нуклеотидов, наличие которых является характерным признаком генома эукариот. Ка примере генома Sulfolobua acidocaldarlua выяснено, что простые последовательности архебактериального генома обладают теми же основными характеристиками, что и простые последовательности генома эукариот. Впервые показано, что в геноме архебактерии suifolobus acidocalda-rlus отсутствуют повторяющиеся последовательности.
Научная и практическая значимость работы. Полученный экспериментальный материал способствует уточнению наших представлений об эволюционных взаимоотношениях трех существующих царств живого. Он свидетельствует об одновременном' наличии у архебактерии молекулярных признаков фенотипа, присущих либо только эубактериям8 либо только эукариотам, и вкупе с существующими данными литературы указывает на возможность близости архебактериального фенотипа к анце-стральному. Такая точка зрения предполагает, что либо архебактерии древнее, чем зубактерии и эукариоты, и дали начало этим последним, либо же, если у трех царств был один общий предок, то архебактерии в наибольшей степени сохранили сходство с ним.
- о -
Свидетельствуя о структурно-функциональных особенностях организации архебактерий на молекулярном уровне, результаты работы создают основу для нового направления исследований - молекулярной биологии архебактерий.
Полученные данные дают возможность вплотную подойти к выяснению путей эволюции аппаратов репликации и транскрипции; разработка методов выделения и характеристика ДНК-зависимых ДНК-полимераз и РНК-полимераз экстремально термофильных архебактерий представляется необходимой предпосылкой для успешного изучения этих вопросов.
Все ферменты, выделенные и очищенные из экстремально термофильных архебактерий - ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, ДНК-зависимые РНК-полимеразы, рестриктирушие нуклеазы - высокотермостзбильны и термофильны и могут быть использованы для научных и практических целей в условиях, когда обычные мезофильные ферменты либо денатурируются, либо находятся в неактивном состоянии. Полученные препараты указанных ферментов используются в лабораторных исследованиях в Институте экспериментальной кардиологии ВКНД АМН СССР и Новосибирском Институте биоорганической химии Сибирского отделения АН СССР.
Результаты работы вошли в курс "Молекулярная биология и генная инженерия", читаемый студентам Физического факультета Тбилисского государственного университета.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 1-ой международной конференции по архебактериям (Мартинсрид-Мюнхен, 1981г.), ІУ-ом советско-французском симпозиуме "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982г.), всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" (Москва, 1983г.), симпозиуме Федерации европейских микробиологических обществ "Эволюция прокариот" (Мюнхен, 1984г.), У1-ом всесоюзном симпозиуме "Конформационные изменения биополимеров в раст-
ворах" (Тбилиси, 1985г.), УП-ом съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985 г.), П-ом рабочем совещании "снзимология матричного синтеза нуклеиновых кислот " (Новосибирск, 1986 г.), республиканской конференции "Современные достижения' микробилогии и вирусологии в сельском хозяйстве и промышленности" (Тбилиси, 1986 г.), УІ-ом всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987 г.), рабочем совещании по архебактериям (Цушино, 1987 г.), международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987 г.), международной конференции по биохимии (Пекин,1987г.), У-ом съезде Всесоюзного общества генетико» и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987 г.), Х1У-ом международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988 г.); выставлялись в павильоне АН ГССР на ВДНХ ГССР (Тбилиси, 1987-1988 г.г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания условий эксперимента (глава 2), изложения результатов экспериментальных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 289 страницах, содержит 47 рисунков и 25 таблиц. Список литературы включает 349 наименований, в том числе 32 на русском языке.