Введение к работе
ir.lil_ 'Актуальность пробда»щ. Нетилзрование ДНК у эукариот рассматривается как один из способов модуляции активности генома, а именно ого основных генетических процессов - репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации ( транспозиции ) [Ваншш,1983, Adama, 19851. Ло спх пор кы мало знаем о том, как организовано кэтялированиэ ДНК в клэтпах рястенкя, характеризующихся са?:нм высоким уровнем метилирования ДНК среди эукариот [Ваншин, 1SG0, 1972, 1974, 1383; АЛаяв.1985]. Лкаь сравнительно недавно была выявлена и изучена каскадная, двухэтапная организация процесса метилирования ДНК в rapacTetie проростков ппеницы, указыввкаая на возможное участие этого процесса в определении очередности и точности репликации отдельных компартментов генома в клеточном цикле делязцпся клеток растеїсйі [Кприос и др.,1988; Vanyushin.KirnoB, 1988]. Однако не было изввстпо, пак метилируется ДНК в рзплицнрупценся геноме недпфГеренщфовакных плеток п культуре. Поэтому оставалось неясным, является ли талал двухэтапная организация процесса метилирования ДН1{ спощттпчным для клеточной дяффэрэнциропяп п іюрфогенозп ігли обгг^м для делящихся тст.эток однодольных способом модаХккащш реплицнрупдогося генокз. Кре,*:э того, не было известно, специален ЛИ ЭТОТ К9І8НИЗМ для клеток однодольных, или on является общим как ДЛЯ ОДНОДОЛЬНЫХ, Т"С и для двудольных растений. Наконец, вазшо было знать, какое место неостр занимает двухэташюэ метилирование ДНК в иерархии механизмов гп5!Гі«аГіГїес!соЛ кодифгсацнн генома растения па разных этапах его Фортарспьтая.
Цель п за дата исследования. Основной цольв диссортационксЗ рйОоти яеядось изучение неіантагов мзтазрования ДНК метоп ЕЫСЗЛХ рг.стоякїї яри репликация геноме. Соответственно, зядачвия последога-
ния были:
-
Подбор и исследование растительных моделей (недифференцированные суспензионные и каллусные культуры клеток, меристемы форыиру ющшсся листа и корня однодольных и двудольных растении), в клетках которых реализуется процесс репликации генома без заметной амплификации отдельных последовательностей и/или андоредупликации.
-
Изучение организации эталности метилирования реплицирующего^ генома в клетках растении:
а) выявление этапа репликативного метилирования ДНК;
0) определение соотношения репликативного и пострешшкативноп
атапов метилирования ДНК; в) определение уровня метилирования комплементарны! цепей в
новообразованных дуплексах ДНК.
3) Исследование влияния недометилирования ядерной ДНК в S-фазо
клеточного цикла на компетентность генома к новым циклам репднхацг
4) Анализ синтеза и метилирования ДНК в прекративших
репликацию генома и дифференцирующихся клетках растений.
Научная новизна работы. Впервые показано, что двухэтапны! процесс метилирования ядерной ДНК является общим для клеток ВЫСШЕ растения механизмом модификации реплицирующегося генома. При избирательном синтезе отдельных последовательностей вне репликации ге нома реализуется иной, вероятно, одноэтапный механизм метилирован яДНК. Путем разделения, выделения и анализа уровня метилирования комплементарных родительской и дочерней цепей непосредственно выя лен асимметричный характер метилирования новообразованных дуплекс яДНК. Впервые доказано, что в двухэтапном механизме метилирования реплицирующегося генома соотношение репликативного и постреплика-тивеого этапов метилирования в недаїфвренцированшх клетках в Kyj туре s в ыэристеиэ целого растения коаэт заметно различаться; пр
втом определяющим в соотношении является репликативный этап. Установлено, что 5-азацитидин ингибирует метилирование ядерной ДНК в S-фазе клеточного цикла и "консервирует" в ней асимметрично метилированные сайты, что препятствует нормальной репликации генома в последующих клеточных циклах. Это подтверждает предположение об участии двухэталного метилирования генома растений в регуляции очередности и точности репликации его последовательностей в клеточном цикле [Клрнос и др.,1983; Vanyushin, Kirnoe, ідеє]. Показано, что при дкфференцировке растительных клеток на фоне блока репликации ядерного генома реализуется синтез "тяжелой"(р = 1,716 г/сиг) популяции миникольцевых молекул мтДНК. В листе и колеоптиле целых развивающихся проростков пшеницы этот синтез цикличен и скоординирован с циклами репликации яДНК в клетках меристемы первого листа. В колеоптиле срезанных проростков наблюдается суперпродукция этой фракции мтДНК, приводящая к ее резкому накоплению в клетках этого органа.
Практическая значимость работы. Работа имеет теоретический характер. Ее результаты вааны для понимания ролл метилирования в генетических процессах у эукариот, в том числе в репликации ДНК у растений. Оли могут использоваться в курсах лекций по молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений.
Апробация работы. Материалы работы были представлены па Всесоюзном симпозиуме "Физиология семян", Душанбе, 1983 г., на Всесоюзной конференции "Частная генетика растений", Киев, 1939 г., на Международной школе по молекулярной генетике, ЧССР, либлицэ, 1989 г., на симпозиуме Индийского общества генетиков и селекционеров рзстеяхЗ, индия, Дели, 1991 г., на совместном заседании сектора молекулярных основ онтогенеза Нэгфнкулътетской проблемной наутно-исследоватоль-скси лаборатории молекулярной биологии и бкоорганіпеской химии їїм.
А.Н.Белозерского ЦГУ и кафедра молекулярной биологии Биологического факультета ЫГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит ез введення, об-оора литературы, описания материалов и методов исслэдования, езло-гания результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (152 наименований). Работа изложена на 1Z3" стр. машинописи, содержит 24 рисунка, б таблиц.