Введение к работе
Системы свертывания крови и фибриполнза являются важнейшими элементами гемостаза. Их правильное функционирование обеспечивает поддержание жидкого состояния крови, защиту организма от кровопотерь и эффективное удаление нежелательных отложений полимерного фибрина, приводящих к образованию тромбов и закупорке кровеносных сосудов.
Основная функция системы свертывания крови заключается в защите организма от потерь крови при повреждении кровеносных сосудов. Она включает в себя каскад биохимических реакции, направленных па превращение мопомерног о фибриногена в полимерный фибрин, являющиеся основой кровяного сгустка. Различные ішрушення в этой системе, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, могут приводить к серьезным последствиям для организма, например, тромбозам. Для успешной борьбы с ними необходимо глубокое понимание молекулярных механизмов свертывания крови, требующее знания структуры и функции отдельных белковых компонентов этой системы.
Фибриноген является важным белком, принимающим участие в поддержании гемостаза. Уже на первой стадии свертывания крови он взаимодействует с тромбоцитами, способствуя их агрегации, которая является первичным процессом в закупорке поврежденных сосудов. После активации тромбином фибриноген превращается в мопомерпый фибрин. Последний спонтанно полимернзуется и образует фпбрнповую сеть, которая является основой кровяных сгустков, закупоривающих места повреждения и препятствующих потере крови организмом. Полимерный фибрин участвует в активации фибринолитической системы, а именно, является матрицей, на г.отрой плазмнногеп активируется в плазміні при помощи тканевого активатора нлазминогена. Фибриноген также ускорясг активацию ХШ фактор» свертывания крови и взаимодействует с рядом белков: фіібронекініюм, тромбоспондшюм, коллагеном (тип IV) и др. Это далеко не полный перечень процессов и взаимодействий, в которые вовлечен фибриноген.
Вообще, для таких крупных белков, как фибриноген, характерна нолнфупкцнопальиость. Такая подифупкциопалыюсть, как правило, связана с их мулыидоменной структурой. Детальные знания доменной структуры белков позволяют глубже ПОІ1ЯІ1. механизм ич функционирования. Поэюму вопрос о сірукіурпой организации фибриногена является ключевым в понимании молекулярных механизмом самосборки фибрина и роли фибрииоі єна ч поддержании іечосіаза.
Цель и задачи исследования: Целью данной работы явилось выяснение доменной организации молекулы фибриногена и изучение функциональном роли его отдельных доменов.
Для достижения этой Цели,было необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить детально процесс тепловоІІ денатурации фибриногена и ею фрагментов. Проанализировать отдельные температурные переходы в фибриногене и его фрагментах и выяснить количество доменов в молекуле фибриногена.
2. Изучить структурные характеристики отдельных доменов и выясни і ь, какими участками Нолипентидных цепей они сформированы.
3. Изучить функциональную роль отдельных доменов и механизм их участия во внутримолекулярных и межмолекуляриых взаимодействиях.
Научная новизна работы. В работе впервые детально изучен процесс тепловой денатурации фибриногена Методом дифференциально!) сканирующей калориметрии. Кроме известных низко- и высокотемпературного переходов были обнаружены второй низкотемпературный и второй высокотемпературны/! переходы.
- Показано, что C-концевьІе участки двух Act - цепей, попреки суще
ствовавшим представлениям, образуют компактные структуры (аС-
домены), которые взаимодействуют между собой и денатурируют в области
второго низкотемпературного перехода.
- Ограниченным Нротеолизом Оц-фраї меііта получен термостабильпыП
участок фибриногена (TSD-фрагмент), плавящийся в области второго
высокотемпературного перехода. Экспериментально показано, что он
представляет собой тройную суперсииральпую структуру, существование
которой было предсказано ранее (Cohen. 1961: Doolittle et al., 1978).
- Обнаружен дискретный характер дальнейшєі о протсолпза Оц-фрагмепга, соответствующего терминальным областям фибриногена, и получен ряд новых протсолитических фрагментов (Dx, DY, Dz, TSD), отличающихся друг от друга набором доменов.
- На основании термодинамического анализа отдельных депатурацпоппых'
переходов в фибриногене и его фрагментах и анализа процесса нригсолпза
Dii-фрагмента показано, что молекула фибрішоїсна cocroiu не из трех, как
предполагалось ранее, а из 14 доменов, которые имеют различную
стабильность и денатурируют независимо в четырех температурных
об пастях. Выяснено, какими участками полнгюпидпых цепей сформированы
см цельные домены. Предложена модель доменной организации молекулы
фибриногена.
Изучена роль аС-доменов в процессе самосборки фибрина. Показано, что они несут дополнительные центры полимеризации, взаимодействие между которыми существенно ускоряет самосборку фибрина в разбавленных растворах.
Установлено, что под действием плазмина в присутствии Са2+ Он-фра-гмент фибриногена превращается в П^д-фрагмент, имеющий в 3,5 раза более высокую аптиполнмеризациопную активность. Это превращение происходит путей расщепления пептидной связи в его Р-цепи и напоминает процесс активации профермента в фермент. Обнаруженное явление, по-видимому, представляет дополнительный механизм регуляции процесса самосборки фибрина путем повышения аптиполнмеризациопной активности продуктов его протеолнза.
Фибриноген явился первым крупным белком со сложной химической структурой, для которого была выяснена детальная доменная структура методами сканирующей калориметрии и ограниченного протеолнза. Большинство обнаруженных нами доменов было впоследствии визуализировано методом электронной микроскопии другими исследователями.
Апробация результатов работы, Материалы диссертации докладывались на: VIII Всесоюзной конференции по калориметрии и химической термодинамике (Иваново, 1979); IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); V Всесоюзном совещании по конфирмационным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980); Всесоюзной конкуренции молодых учетных (Паку, 1981); Международном симпозиуме но биокалоримегрин (Тбилиси, 1981); IV Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск, 1982); VI Двустороннем симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 1982); VI Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига, 1983); IV Симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984); V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985); V Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987); Всесоюзной конференции По спектроскопии растворов биополимеров (Харьков, 1988); Международных симпозиумах по фибриногену (Милуокки, 1988; Киото, 1989; Руаи, 1990); II Симпозиуме Американскою общее і ва белковиков (Сан-Диего, 1988); XII Конгрессе Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза (Токио, 1989), а іакже в лабораториях Д-ра М.Моссссона (Милуокки, 1988), д-ра Р.Дулитгла (Ла-Хойя, 1988), д-ра А.Будзинского (Филадельфия, 1988, ' 1990), д-ра В.Бломбака (Нью-Йорк, 1988), д-ра К.Коэн (Бостон, 1989).