Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем, стоящих перед совремешюй молекулярной биологией, является расшифровка механизмов матричных процессов: репликации, транскрипции и рекомбинации, связаных с конформационными изменениями в молекуле ДНК. На сегодняшний день природа и молекулярные механизмы этих процессов изучены недостаточно. Известно, что ДНК эукариотической клетки имеет сложную надмолекулярную структуру и образует сверхспиральные петли с концами, фиксированными на ядерном матриксе. Таким образом, для протекания любого генетического процесса, связанного с разделением комплементарных цепей ДНК, необходимы топологические перестройки такой замкнутой структуры. В этой связи большой интерес представляет изучение ДПК топоизомераз - ферментов, катализирующих топологические перестройки ДНК, включая введение и удаление сверхвитков, узлообразование, образование катенанов и декатенацию, и, таким образом, играющих ключевую роль во всех аспектах метаболизма ДНК, поддержании стабильности генома и регуляции структуры хроматина.
Структурно-функциональные исследования топоизомераз приобрели особо важное значение после обнаружения того факта, что ферменты этой группы являются единственной клеточной мишенью для многих известных соединений с противо микробной и противоопухолевой активностью. Это открытие, вызвавшее интенсивный поиск и изучение природных, а также создание новых синтетических производных, считают одним из основных в противоопухолевых исследованиях последнего десятилетия. В настоящее время признано перспективным изучение соединений, способных специфически взаимодействовать с молекулой ДНК и, тем самым, влиять на каталитическую активность топоизомераз, модулируя узнавание ДНК ферментом и способствуя образованию долгоживущих ДНК-белковых комплексов, разрывов ДНК и клеточной гибели.
Таким образом, данные сравнительного изучения сайт-специфичности топоизомераз по отношению к определенным нуклеотщцгым последовательностям и особешюстей взаимодействия с ДНК лигандов с различными структурными детерминантами, а также исследование молекулярных механизмов влияния этих соединений на различные стадии ферментативного катализа являются необходимыми для разработки принципов
конструирования адресных селективных ингибиторов топоизомераз и создания новых противоопухолевых препаратов.
В последние годы в области изучения топоизомераз был достипгут значительный прогресс, однако ключевые проблемы, связанные с множественностью функций топоизомераз различных классов и их структурно-фуїшииональїіьгми различиями, а также с принципиалыюй сложностью изучения молекулярных механизмов катализа, определяемых конформационными переходами ферментов, остаются открытыми.
Пели и задачи исследования. Основными целями настоящей работы являются:
а) создание эффективной системы экспрессии для получения рекомбинантной
топоизомеразы I человека; выделение и очистка фермента в количествах достаточных
для структурно-функциональных исследований;
б) биохимическая характеристика и изучение каталитической активности
рекомбинантного С-концевого 68-кДа фрагмента топоизомеразы I человека;
в) характеристика структуры рекомбинантной 68-кД топоизомеразы I человека и её
комплекса с «суицидным» ДНК-субстратом в растворе методами оптической
спектроскопии;
г) сравнительный анализ влияния новых синтетических соединений с потенциальной
противоопухолевой активностью (производных Хёхста, антибиотиков нетропсина и
дистамицина) на сайт-специфичность и каталитическую активность топоизомеразы I
человека,
д) исследование молекулярных механизмов модуляции новыми синтетическими
лтиндами процесса образования тройных комлексов с участием ДНК, фермента и
камтотецина - классического специфического ингибитора топоизомеразы I человека.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработана эффективная система экспрессии, выделения и очистки для получения каталитически активной топоизомеразы I (68 кДа) человека в клетках насекомых линии Sf9 в количествах, необходимых для структурно-функішональньгх исследований. Впервые изучены особеїшости структурной оргшшзации топоизомеразы I человека и её комплекса с « суицидным » ДНК-субстратом в растворе с использованием методов оптической спектроскопии.
Создана модельная система для изучения молекулярных механизмов модулирования активности топоизомеразы I человека соединениями, связывающимися по малой бороздке ДНК. Система представляет собой набор сконструировашгых
плазмид, ДІЖ которых содержит места связывания различных лигандов, камптотецин-зависимые и камптотецин-независимые специфические последовательности, узнаваемые ферментом, в различных комбинациях и в различной ориентации относительно друг друга.
С использованием созданной системы впервые :
а) изучено сравнительное влияние на специфическую активность топоизомеразы I
человека десяти новых синтетических производных Хёхста 33258, антибиотиков
нетропсина и дистамицина;
б) обнаружена способность указанных соединений влиять на образование долгоживущих
тройных комплексов топоизомераза 1/ДНК/камлтотеция.
С помощью методов оптической спектроскопии определены молекулярные механизмы связывания синтетических производных нетропсина с ДІЖ. На основании полученных результатов отобраны наиболее перспективные производные для синтеза селективных ингибиторов топоизомеразы I человека - конъюгатов производных нетропсина и камптотецина. Разработанный экспериментальный подход и полученные результаты представляются перспективными для моделирования и синтеза новых препаратов с потенциальной противоопухолевой акивностью.
Публикации. Основные результаты представленной работы изложены в 8 печатных работах.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на следующих международных конференциях: «Summer School Biosensing Materials», Pushchino, Russia, July 7-13, 1994; «Methods in Protein Structure Analysis», Snowbird, Utah, USA, сентябрь 1994; «XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy», Prague, Czech Republic, август 1998; «16th International Conference on Raman Spectroscopy», Cape Town, South Africa, сентябрь 1998, «6th International Conference of Anticancer Research», Kallithea, Halkidiki, Greece, октябрь 1998.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора