Введение к работе
Актуальность проблемы. Антитела относительно давно стали применять в терапии ряда заболеваний, в том числе и вирусных инфекций, благодаря исключительным свойствам этих природных биомолекул - высокой специфичности, наличию эффекторных функций, способности проникать в ткани и выводиться из организма с помощью естественных механизмов. Однако, применение поликлональных антител, выделенных из донорской крови, имеет ряд недостатков (Maynard and Georgiou, 2000), наиболее серьезным из которых является биологический риск, связанный с возможностью инфицирования неидентифицированными патогенами. Кроме того, сырьевая база для получения специфических поликлональных антител всегда ограничена, и стандартизовать эти препараты очень трудно из-за различающихся от партии к партии соотношений белок/специфические антитела. Серьезной проблемой является и то, что не все антигены можно использовать для иммунизации добровольцев, например, получить человеческие сыворотки против высокопатогенных инфекционных агентов или токсических агентов практически невозможно. Использование в терапии моноклональных антител (МКА) также имеет серьезные ограничения. Большинство имеющихся МКА производятся гибридомными клетками животных, и введение их в организм человека вызывает развитие нежелательной иммунной реакции, особенно при повторном введении. Кроме того, эффекторные функции МКА животных недостаточно активируются в организме человека, у них слишком короткий период полувыведения из организма. Получение высокоаффинных МКА человека, стабильно продуцируемых гибридомными клетками, к настоящему времени затруднено из-за отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы (Karpas et al., 2001; Traggiai et al., 2004). Спектр антител, получаемых с помощью гибридомных клеток человека, ограничен: так, получить антитела против патогенных и токсичных агентов, а также против собственных белков человека не представляется возможным (Laffly and Sodoyer, 2005). Наконец, не стоит забывать, что гибридомные клетки трансформированы, и, вследствие этого, препараты на их основе потенциально опасны как онкогены.
Новые перспективы в этой области открывают ДНК-технологии. Одним из направлений в получении МКА человека является создание трансгенных животных, у которых собственные гены, кодирующие иммуноглобулины, заменены на человеческие (Kellermann and Green, 2002; Laffly and Sodoyer, 2005). Однако, не все желаемые антитела можно получать таким образом из-за токсичности ряда антигенов для организма животного.
Еще одно активно развивающееся направление в разработке рекомбинантных антител основано на направленном дизайне генов, кодирующих иммуноглобулины, методами генетической инженерии. Так, к настоящему времени разработаны и используются в медицинской практике так называемые «химерные» антитела, состоящие из вариабельных доменов мышиных антител, обладающих целевыми свойствами, и константных доменов иммуноглобулинов человека. Создаются также и «гуманизированные» антитела, в которых только гипервариабельные участки человеческих антител заменены на мышиные.
Вместе с тем очевидно, что полностью человеческие рекомбинантные антитела (fully human antibodies) являются наиболее предпочтительными. Для их создания объединяют вариабельные домены антител человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами иммуноглобулинов человека нужного
изотипа. Такие антитела синтезируют в эукариотических клетках, обеспечивающих правильную конформацию и гликозилирование молекул иммуноглобулинов.
Ключевой стадией в создании полноразмерных антител человека является получение вариабельных доменов, отвечающих за специфичность антитела, его аффинность и биологические свойства. Одним из способов их получения является отбор вариабельных доменов из комбинаторных фаговых библиотек мини-антител. Каждый бактериофаг в такой библиотеке экспонирует на своей поверхности только одно антитело уникальной специфичности (фаговое антитело). Репертуар антител в
таких библиотеках может достигать 10 различных мини-антител. В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами. Для получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli.
Сами мини-антитела находят применение в терапии некоторых заболеваний. Обладая меньшими размерами, они легче проникают в ткани, преодолевают гематоэнцефалический барьер, вызывают меньший неспецифический иммунный ответ (Ewert et al., 2003). На их основе конструируют полифункциональные мини-антитела, иммунотоксины, средства адресной доставки лекарственных средств в организме больного.
В настоящее время мини-антитела и рекомбинантные полноразмерные антитела применяют в фундаментальных исследованиях, в биотехнологии, в терапии различных заболеваний, включая вирусные. Разработка противовирусных рекомбинантных антител ведется очень широко, однако лишь ограниченное количество работ, посвящено получению рекомбинантных антител, направленных к особо опасным для человека вирусным патогенам.
В число основных направлений деятельности ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» входят фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, и разработка средств лечения заболеваний, вызываемых вирусными инфекциями. Именно поэтому целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител, направленных к вирусным патогенам и, прежде всего, особо опасным вирусам, патогенным для человека.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
создать экспрессионную систему, обеспечивающую высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках E.coli, и на примере одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита, исследовать особенности экспрессии целевых генов с использованием созданной конструкции, изучить иммунохимические свойства продуцируемых антител;
отобрать из имеющейся синтетической фаговой библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к вирусу Эбола и ортопоксвирусам, включая жизнеспособный вирус натуральной оспы (штаммы variola major и variola minor alastrim); исследовать иммунохимические и биологические свойства отобранных антител;
сконструировать натуральную наивную библиотеку одноцепочечных антител человека и охарактеризовать ее, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела к различным антигенам, включая вирусные; сконструировать натуральную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе генетического материала периферических лимфоцитов доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к различным ортопоксвирусам, исследовать их иммунохимические свойства;
выявить одноцепочечные антитела человека, способные ингибировать инфекционность ортопоксвирусов, определить белки-мишени для этих антител; - на основе одноцепочечных антител человека, направленных к вирусу Эбола и к ортопоксвирусам, сконструировать полноразмерные антитела человека и исследовать их иммунохимические свойства. Научная новизна результатов исследования.
Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины.
Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к жизнеспособным ортопоксвирусам - вирусу натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусам осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы.
Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы.
Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии.
Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, slF4, slI6, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы.
Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к белкам вируса Эбола; созданы штаммы Escherichia coli HB2151/pHEN-4Dl и Escherichia coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4Dl и s2E3 в растворимой форме.
Сконструированы полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам и к вирусу Эбола. Показано, что полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам, обладают вируснейтрализующей активностью.
Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена.
На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.
Практическая значимость работы.
В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам.
Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами к ортопоксвирусам. Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, направленных к ортопоксвирусам, и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем.
Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека к широкому спектру антигенов.
Получено одноцепочечное антитело человека к фактору некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4xlOM-\ Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний.
Сконструированы полноразмерные антитела человека к ортопоксвирусам,
обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются
перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VI Всероссийская конференция «Новые направления биотехнологии», 1994, Пущино; «Bayev memorial conference», 1996, Москва; Международная конференция «Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections», 1996, Иркутск; Международный симпозиум "Protein Structure, Stability, and Folding. Fundamental and Medical Aspects", 1998, Москва; «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 1998, 2002, 2006, Новосибирск; школы-конференции «51, б1, Iі John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 2000, 2002, 2005, Пущино, Россия; «Human Antibodies and Hybridomas» 2001, Prague, Czech Republic, 2002, Berne, Switzerland; XII International Congress of Virology, 2002, Paris, France; Международный семинар "Basic Science in ISTC Activities", 2001, Новосибирск, Россия; Международная научно-практическая школа-конференция "Цитокины. Воспаление. Иммунитет." 2002, Санкт-Петербург, Россия; 15th, 16th, 17th, 18th International Symposium of Antiviral Research, 2002, Prague, Czech Republic, 2003, Savannah, USA, 2004, Tucson, USA, 2005, Barcelona, Spain; VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases, 2003, Berlin, Germany; Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2005, Судак, Украина; Международная конференция «Физико-химическая биология» 2006, Новосибирск; International conference "Basic Science for
Biotechnology and Medicine" 2006, Novosibirsk, Russia; VII Межгосударственная научно-практическая конференция. 2006, Оболенск, Россия. Кроме того, результы докладывались на ежегодных встречах Наблюдательного Комитета ВОЗ по контролю за исследованиями вируса натуральной оспы в 2004, 2005 и 2006 годах.
Материалы диссертации изложены в 15 статьях в научных журналах. Часть результатов защищена патентами РФ (6 патентов )
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 287 страницах машинописного текста и включает 90 рисунков, 14 таблиц и список литературы, содержащий 338 ссылок.