Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время для описания механизма инициации трансляции" эукериотических мРНК используется сканирующая модель, предложенная Н.Козак. В соответствии с этой моделью, 40s ртбосомная субчастица связывается с кепированным Б'-концевым районом мРНК, вторичная структура которого предварительно расплетается факторами инициации трансляции еіР-4Р, єіг-4а и elF-4B. Связавшаяся с матрицей 40s субчастица сканирует б'-нетранслируемух) область (НТО) РНК до встречи с первым aug. кодовом, находящемся в благоприятном яуклеотидном окружении, после чего к ней присоединяется 60S рибосомнвя субчастица, и образовавшийся 80s комплекс начинает непосредственный синтез белка. Эта модель предъявляет, таким образом, определенные требования к структуре мРНК эукариот. В частности, подавляющее большинство эукариотических матриц кэпированы, моноцисгронны, содержат относительно короткие (50-1 БО нуклеотидов) 5*-НТО, а инициация происходит обычно на первом от Б'-конца aug. В связи с этим большой интерес представляет» исследование механизма инициации трансляции некэпированных РНК пикорнавирусов (мелких РНК-содержащих вирусов животных, включающих, в частности, энтеро-, рино-, кардио- и афтовирусы), 5'-НТО которых имеют длину от 600 до 1200 нуклеотидов и содержат до 11 aug триплетов, предшествующих' инициаторному АШ. Инициация трансляции таких РНК происходит в результате кэп-независимого связывания 40s рибосомной субчастицы с внутренним .участком 5'-нетранслирувмой зоны. Однако, детали такого механизма ешв во многом не ясны.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение
цис-действугацих элементов и транс-действующих клеточных факторов,
ответственных за осуществление инициации трансляции РНК вируса
полиомиелита (пикорнавируса, относящегося к роду энтеровирусов)
по механизму внутренней посадки рибосомы. -"
В ввдачу работ входило:
1. Путей направленного мутагенеза ввести нуклеотидше замены в
различные рйоны 5'-ЯГО РНК вируса полиомиелита и исследовать
ТраНСЛЯЦИОЫНуИ аКТИВНОТЬ ПОЛуЧвНННХ КОНСТРУКЦИЙ in uttro в
екстрактах клеток НеЪа, асцитной карциномы Кребс-2 и кроличьем ретЕкулоцвтном лизате.
2. Исследовать влияние данных замен в 5'-НТО на фенотип вируса
полиомиелита in vtvo в клетках HeLa.
3. При помощи метода УФ-сшивания охарактеризовать белки экстракта клеток Hela, взаимодействующие с Є'-нетранслируемой зоной FHK пслковируса.
4. Частично очистить и функционально охарактеризовать эти белки.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате настоящей работы выявлена важная роль в инициации трансляции на полиовирусной матрице полигшримидинбогвтой области и последнего консервативного aog-586 кодона, являнцихся частью характерного для Б'-НТО всех пикоряавирусных РНК структурного елемента Y^-X^-AtfG (где Y - пиримидин, X - любой нуклеотид, a m колеблется от 15 до 25). Показано специфическое взаимодействие Б'-НТО РНК вируса полиомиелита с клеточным белком с молекулярной массой 57 кД (р57). Проведена частичная очистка белка р57 из клеток асцитной карциномы Кребс-2. Установлена идентичность белка р57 и описанного в литературе ядерного белка рРТВ (Garoia-віалоо et аг., 1989, Gil at аг., 1991, Patton et аг., 1991). предполокитэльно принимающего участие в сплайсинге. Получены указания на возможную роль р57 в нэп-независимой внутренней инициации трансляции на полиовирусной РНК. Полученные в работе данные, расширяющие наши знания о механизме квп-независимой внутренней инициации на РНК полиовируса, используются в курсе лекций на кафедре вирусологии Биологического факультета МТУ им. Ы.В.Ломоносова.
Апробация работы, материалы диссертации докладывались на международном симпозиуме по молекулярной и клеточной- биологии "Трансляционный контроль" в Колорадо, США 1991, а также на совместном заседании лаборатории "Взаимодействие вируса с клеткой" НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МТУ
им. М.В.Ломоносова и лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва 1992.
Публикации. По томе диссертации опубликовано 7 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация излонвна на
строшщах машинописного текста и состоит из следующих разделов:
оглавление, введение, обзор литературы (4 главы), описание
мвтодов исследования, -изложение полученных разультатов и их
обсуждение, вывода и список литературы. Диссертация включает
рисунка и таблицы.. Список литературы включает