Введение к работе
,.- -. Наиболее удобной моделью для изучения белок-синтезиругощего аппарата клетки является бесклеточная система, с ее помощью удается проследить весь путь реализации генетического кода от ДНК до готовой белковой молекулы в пробирке.
В настоящее время бесклеточная система синтеза белка может быть составлена из хорошо охарактеризованных, высокоочвденных компонентов. В литературе описаны различные типы бесклеточных систем, в которых в качестве матрицы может быть использована ДНК или природная мРНК, а также синтетические полинуклеотиды. Наиболее простая и хорошо изученная система синтеза пептида состоит из очищенных рибосом, искусственного полинуклеотида, аминоацил-тРНК бел:совых факторов элонгации (ef-tu и ef-g) и ГТФ. Хотя в такой системе отсутствуют стадии инициации и терминации, но синтезируется пептид в соответствии с кодовой специфичностью матричного полинуклеотида.
Разработан ряд других модельных бесклеточных систем трансляции, таких как система бесфакторной ("неэнзиматической") трансляции (в отсутствие факторов элонгации и ГТФ), или твердофазная система трансляции (когда рибосомы считывают матричный полинукле-отид, ковалентно привязанный к твердому носителю - целлюлозе или сефарозе). Эти бесклеточные системы трансляции позволяют проводить функциональные исследования молекулярных механизмов транслокации, а также изучать энергетику рибосомного синтеза белка, ложное кодирование и т.п.
Нами создан новый тип бесклеточной системы, в которой синтез пептида из аминоацил-тРНК на рибосомах осуществляется в отсутствие матричного полинуклеотида.
Пель настоящей работы. Изучение синтеза полипептидов на рибосомах Escherichia, coll в отсутствие матричного полинуклеотида. Решались следущие вопросы: -ї) реализуется ли нормальный механизм элонгации пептида при безматричном синтезе на рибосоме; 2) все ли аминоацил-тРНК являются активными субстратами для безматричного синтеза; 3) что определяет эффективность аминоацйл-тРНК как субстрата для синтеза пептида в отсутствие матрицы - собственно структура тРНК или характер аминокислотного остатка.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые было продемонстрировано, что рибосомы е.соіі в отсутствие матричного полинуклеотида способны полимеризовать аминокислотные остатки в полипептид, используя аминоацил-тРНК в качестве субстрата. Пока-
зано, что при безматричном синтезе реализуется типичный рибосом-ный механизм элонгации пептида, требующий присутствия обоих факторов элонгации, ти и G, и энергии ГТФ. Среди изученных 16 ами-ноацил-тРНК были выявлены как эффективные субстраты для безматричного синтеза, так и неэффективные аминоацил-тРНК, из которых синтеза пептида без матрицы не наблюдали, лучшим субстратом для безматричного синтеза пептида на рибосоме оказалась лизил-тРНК. Показано, что собственно структура тРНК13 определяет ее способность служить субстратом для элонгации пептида на рибосомах в отсутствие матрицы; природа аминокислотного остатка, как оказалось, существенной роли не играет, осуществление транслокации в отсутствие матрицы доказало, что ведущим актом при транслокации является перемещение самой тРНК, а не матрицы..
Предложенная бесклеточная система синтеза пептида в отсутствие матрицы имеет значение как модельная система для более детального изучения рибосомного аппарата клетки. Особенно это касается изучения вклада кодон-антикодоновш: взаимодействий на разных этапах рибосомного синтеза пептида.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 2Ї рисунок, 3 таблицы и список литературы из 231 наименования. Работа состоит из четырех основных глав - "Бесклеточные системы синтеза из Escherichia coli" (анализ данных литературы), "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов" и еаканчивается "Выводами".