Введение к работе
Актуальность темы.
В молекулярной биологин.за последнее десятилетие наметилась определенная тенденция к экстенсивному накоплению фактического материала. При этом методы, разработанные сравнительно давно: выделение плазмидной ДНК, ссквенирование ДНК и амплификация фрагментов ДНК при помоши PCR не заменяются новыми, но претерпевают ряд несущественных модификаций и используются для получения все возрастающего потока фактического материала - нуклеотидных последовательностей, генетических карт, охарактеризованных генов и диагностических зондов.
Увеличение производительности научного труда при анализе генетической информации стало возможзгым благодаря развитию как сети научных лабораторий, так и множества компаний, производящих ферменты, наборы реактивов и оборудование для проведения молекулярно-биологических исследований.
Повышенный интерес научных, коммерческих и политических структур к генетическим исследованиям вообще и к программе "Геном человека" в частности обусловлен надеждой на получение решений важнейших медицинских и сельско-хозяйстпенмых проблем.
В области автоматизации анализа генетической информации уже достигнут ряд существенных успехов: разработаны автоматические секвенаторы ДНК, термоциклеры для проведения PCR, автоматические спектрофотометры для анализа результатов PCR, быстро развиваются методы ДНК-диагностики при помоши PCR.
При этом собственно выделение и подготовка ДНК к анализу эстается самым трудоемким, медленным этапом исследований.
Роботизированные станции для подготовки проб ДНК не чашли широкого применеїшя вследствие своей дороговизны и :ложности технического обслуживания.
Частігчньїм решением проблемы стали коммерчески доетУПНЫе таборы для выделения ДНК, позволившие стандартизгшнеі'і эучного труда компенсировать отсутствие автоматизации..
Таким образом, автоматизация процесса выделения ДНК Н трояготовки ее к последующему анализу является необходимым
условием ускореного продвижения в процессе изучения структурной организации генома.
Цель работы.
-
Создание биохимической и механической концепции автоматического экстрактора плазмидной ДНК.
-
Разработка новой методики для выделения плазмидной ДНК. Создание экспериментальных моделей автоматического экстрактора плазмидной ДНК и поэтапная проверка конструкции.
-
Совершенствование и оптимизация биохимических регламентов и технических параметров автомата.
Научная новизна и практическая значимость работы
Разработана самая быстрая на настоящий момент методика (20мин.) выделения чистой ДНК в нативной форме для рестрикционного анализа и других ферментативных реакций в молекулярном клонировании.
Разработана самая быстрая и принципиально новая методика -7 мин. - экстракции чистой денатурированной плазмидной ДНК непосредственно из бактериальной культуры для секвенирования по Сенгеру.
Обе методики могут быть применены в ручном и автоматическом варианте, причем ни на одном из этапов не требуется визуального контроля за разделением фаз^
Разработан принципиально новый центрифужный прибор, отличающихся от всех предшествующих тем, что весь цикл выделения плазмидной ДНК проводится автоматически внутри ротора оригинальной конструкции, причем реагенты добавляются и распределяются между множеством ячеек поровну непосредственно во время вращения.
Создание центрифужного экстрактора плазмидной ДНК позволило автоматизировать самый трудоемкий этап в процессе анализа генетической информации.
Центрифужный экстрактор плазмидной ДНК может послужить прототипом при разработке нового семейства центрифужных автоматов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот из различных объектов, а также других биохимических и
химических операций. Наиболее перспективными представляются следующие применения для центрифужного экстрактора: экстракция ДНК и РНК из крови и других биологических жидкостей и тканей для медицинской диагностики, экстракция космидной ДНК для картирования генома, выделение и очистка фрагментов ДНК из гелей, выделение и очистка индивидуальных белков из акриламидного геля для секвенирования.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на семинаре ИМБ АН СССР "Автоматизация ссквснирования ДНК и приготовления проб", 1989;
на школе по молекулярной биологии, Секция Биофизики, Нарва, 1990;
на I всесоюзной конференции "Геном человека" Переславль-Залесский, 1990;
на школа по биофизике ВТИНТ, Харьков, 1991;
на семинаре Лаборатории организации генома ИБГ РАН, г.Москва, 1994
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литратуры. Она изложена на 100 страницах, содержит 27 рисунков, библиографический список из 90 названий. Обзор литературы посвящен двум темам: "Методы выделения ДНК" и "Центрифужные автоматы в биохимии".